1.一种农药对蜜蜂幼虫毒性评价方法,其特征在于:步骤为:
(1)试验生物为1日龄的蜜蜂幼虫,3~6日龄开始暴露染毒;以系列浓度组进行预备试验;根据预备试验确定的浓度范围,正试验设置不少于5个覆盖EC50/ED50和/或NOEC/NOED的浓度组,同时设空白对照组,当使用溶剂时,增加设置溶剂对照组;
(2)正试验结果观察:于第4d~8d及第15d观察并记录幼虫死亡数、其它异常情况,身体僵硬不动或轻微触碰无反应或第15d未化蛹的幼虫则判定为死亡,同时将死亡的幼虫去除,第22d观察并记录蛹死亡数、羽化数及观察到的异常情况;
(3)药剂对蜜蜂幼虫EC50/ED50或者NOEC/NOED值的测定:蜜蜂幼虫毒性试验以羽化率为主要评价指标,统计蜜蜂发育的幼虫死亡率、蛹死亡率、羽化率,进行统计学分析计算EC50/ED50及置信限;采用方差分析对各个浓度处理组与对照组间进行差异显著性分析,获得供试物对蜜蜂羽化影响的NOEC/NOED。
2.如权利要求1所述的农药对蜜蜂幼虫毒性评价方法,其特征在于:蜜蜂幼虫获得的方法为:
(1)首先,将蜂王限制在有工蜂和空巢脾的幽王产卵器中,禁闭24h,待其产卵后释放蜂王,产卵75h后用移虫针将1日龄的幼虫随机转移至温度34℃~35℃的育王台基中,每个台基放入1只幼虫,然后将移入了幼虫的王台基置于24或48孔细胞培养板;每个培养板含有来自3个种群的幼虫;幼虫在试验条件下,用人工饲料饲养;
(2)在化蛹培养板中放入纸巾,将纸巾贴合孔的底部和边缘,将蛹培养板和盖子进行紫外灭菌15分钟;当D6~D8蜜蜂幼虫消耗完所有食物时,就将幼虫从培养板转移到化蛹培养板中;
(3)在幼虫或预蛹转至化蛹板之前,保持相对湿度95%±5%;预蛹转至化蛹板之后至化蛹板放入孵化盒之前,保持相对湿度80%±5%,化蛹板放入孵化盒之后至试验结束,保持相对湿度50%~80%;试验期间将干燥器放置于蜜蜂幼虫孵化器中,使干燥器温度均匀保持在34℃~35℃,黑暗的条件下进行;蜜蜂幼虫达到3日龄开始试验。
3.如权利要求2所述的农药对蜜蜂幼虫毒性评价方法,其特征在于:幼虫人工饲料的成分包括但不限于蜂皇浆、酵母提取物、果糖、葡萄糖;蜜蜂幼虫使用的三种饲料的成分及重量份为:
饲料A为:酵母提取物:葡萄糖:果糖:无菌水:鲜蜂王浆=0.9:5.3:5.3:44.25:44.25;
饲料B为:酵母提取物:葡萄糖:果糖:无菌水:鲜蜂王浆=1.3:6.4:6.4:42.95:42.95;
饲料C:酵母提取物:葡萄糖:果糖:无菌水:鲜蜂王浆=2:9:9:30:50;1日龄饲喂20μL饲料A,2日龄不进行饲喂,3日龄饲喂20μL饲料B、4日龄饲喂30μL饲料C、5日龄饲喂40μL饲料C、6日龄饲喂50μL饲料C。
4.如权利要求3所述的农药对蜜蜂幼虫毒性评价方法,其特征在于:饲料配置时需先将果糖、葡萄糖和酵母提取物完全溶解于无菌水后再与新鲜王浆混匀;混匀食物采用采用手动搅拌和涡旋振荡的方法;饲料新鲜配制并保存在0~5℃的冰箱里;或提前制备,冷冻保存直至使用。
5.如权利要求2所述的农药对蜜蜂幼虫毒性评价方法,其特征在于:步骤(2)中的纸巾为:1m×2cm的纸巾。
6.如权利要求2所述的方法,其特征在于:步骤(1)移虫前将培养板、移虫针、人工育王台基浸没在70%酒精至少30min进行杀菌后,晾干待用;往每个培养板移虫时间≤20分钟;使用移液器向每个王台基内供应食物。
7.如权利要求1所述的农药对蜜蜂幼虫毒性评价方法,其特征在于:所述的暴露染毒的步骤为:每天用混有供试物的饲料饲喂蜜蜂幼虫,3日龄饲喂20μL饲料B、4日龄饲喂30μL饲料C、5日龄饲喂40μL饲料C、6日龄饲喂50μL饲料C;使用水溶解的供试物,投喂的含毒饲料中受试溶液的量为≤10%;或使用有机溶剂溶解,投喂的含毒饲料中受试溶液的量≤2%。
8.如权利要求1所述的农药对蜜蜂幼虫毒性评价方法,其特征在于:预备试验使用细胞培养板,设置空白与溶剂对照组:每个浓度3个重复,每个重复12头幼虫。
9.如权利要求1所述的农药对蜜蜂幼虫毒性评价方法,其特征在于:正试验为:根据预备试验确定的浓度范围,按几何级差应≤3倍设置不少于5个覆盖EC50/ED50和/或NOEC/NOED的浓度组;设空白对照组,当使用溶剂时,增加设置溶剂对照组,对照组及每一剂量组均设3个重复,每个重复16只幼虫。
10.如权利要求1所述的方法,其特征在于:暴露染毒过程中温度为23-40℃,每24h内出现偏差次数小于≤1次。