一种长喙毛茛泽泻微繁方法与流程

本发明涉及一种长喙毛茛泽泻微繁方法，属于园艺林业技术领域。

背景技术：

长喙毛茛泽泻(Ranalisma rostratum)是一种濒危的水生草本植物，隶属泽泻科毛茛泽泻属，产于我国浙江、江西、湖南及越南和马来西亚，国内目前只在江西、湖南发现了零散的小群居，而且群居数目和个体仍在减小，说明这种植物已处于严重的濒危状态。目前，关于长喙毛茛泽泻的组织工程育苗鲜有报道。而如何扩大其种群数量，并对该植物进行保护，是迫切解决的问题。

基于此，做出本申请。

技术实现要素：

针对现有长喙毛茛泽泻的现状，本申请提供一种可实现无性人工繁殖、成活率高的长喙毛茛泽泻微繁方法。

为实现上述目的，本申请采取的技术方案如下：

一种长喙毛茛泽泻微繁方法，将清洗后的长喙毛茛泽泻作为外植体进行灭菌得到无菌苗，在无菌苗上选取微繁器官进行生根培养，得到的组培苗移栽即可。

进一步的，作为优选：

所述的微繁器官为无菌苗的茎段、叶片或叶柄，该微繁器官进行芽诱导后再进行生根培养。更优选的，所述的茎段选用带有分生组织的茎段。所述的诱导培养基是由MS培养基和6BA(6-苄氨基嘌呤)、KT(激动素)、IBA(吲哚丁酸)、ZT(玉米素)中的至少两种构成，6BA、KT、IBA、ZT中的至少两种添加在MS培养基中；所述6BA的添加浓度为0.2-4mg/L，所述KT的添加浓度为0.2-2mg/L，所述IBA的添加浓度为0.4-1mg/L，所述ZT的添加浓度为0.2-1mg/L。

所述的微繁器官为无菌苗的匍匐茎，该匍匐茎直接生芽繁殖得到组培苗。

所述的无菌苗培养基是由MS培养基和特美汀和/或头孢霉素，特美汀和/或头孢霉素添加在MS培养基中。更优选的，所述的MS培养基先灭菌后再添加特美汀和/或头孢霉素。

所述的生根培养基为未添加激素的MS培养基。

所述的MS培养基的pH为5.8-6.0，其化学成分及用量如下(工作液浓度单位：mg/L)：大量元素：NH₄NO₃(1650)，KNO₃(1900)，CaCl₂·2H₂O(440)，MgSO₄·7H2O(370)，KH₂PO₄(170)；微量元素：KI(0.83)，H₃BO₃(6.2)，MnSO₄·4H₂O(22.3)，ZnSO₄·7H₂O(8.6)，Na₂MoO₄·2H₂O(0.25)，CuSO₄·5H₂O(0.025)，CoCl₂·6H₂O(0.025)；铁盐：FeSO₄·7H₂O(27.8)，Na₂-EDTA·2H₂O(37.3)；有机物质：肌醇(100)，烟酸(0.5)，盐酸吡哆醇(维生素B6)(0.5)，盐酸硫胺素(维生素B1)(0.1)，甘氨酸(2.0)。

所述的MS培养基中添加有琼脂，琼脂的添加浓度为5.4-5.8g/L。

附图说明

图1为本申请中长喙毛茛泽泻外植体接种6天的状态图；

图2为本申请中外植体培育30天时得到的无菌苗侧面图；

图3为本申请中外植体培育30天时得到的无菌苗俯视图；

图4为图3中的无菌苗单株；

图5为图3中的无菌苗纤匍枝；

图6为本申请中长喙毛茛泽泻叶片培育20天时的状态图；

图7为本申请中长喙毛茛泽泻叶柄培育20天时的状态图；

图8为本申请中长喙毛茛泽泻带分生组织的茎段诱导30天时的状态图(培养基：MS+6BA 2.0mg/L+KT 2.0mg/L+IBA 0.4mg/L)；

图9为图8中诱导培养得到的单株状态图(箭头指示不定芽)；

图10为生根状态图(即图8的仰视图)；

图11为移栽效果图。

具体实施方式

1.材料与方法

1.1实验材料

长喙毛茛泽泻幼苗由浙江林业科学院石从广博士提供，本实验室人工气候室培养，实验材料采用该植物的叶片、叶柄和带有分生组织的茎段。

1.2培养基与培养条件

1.2.1 MS培养基配方

MS培养基作为基本培养基，其化学成分及用量如下(工作液浓度单位：mg/L)：大量元素：NH₄NO₃(1650)，KNO₃(1900)，CaCl₂·2H₂O(440)，MgSO₄·7H2O(370)，KH₂PO₄(170)；微量元素：KI(0.83)，H₃BO₃(6.2)，MnSO₄·4H₂O(22.3)，ZnSO₄·7H₂O(8.6)，Na₂MoO₄·2H₂O(0.25)，CuSO₄·5H₂O(0.025)，CoCl₂·6H₂O(0.025)；铁盐：FeSO₄·7H₂O(27.8)，Na₂-EDTA·2H₂O(37.3)；有机物质：肌醇(100)，烟酸(0.5)，盐酸吡哆醇(维生素B6)(0.5)，盐酸硫胺素(维生素B1)(0.1)，甘氨酸(2.0)。

1.2.2抗生素培养基/无菌苗培养基

可选用三种作为比对案例：(1)MS+特美汀200mg/L(单位下同)+头孢霉素200；(2)MS+特美汀200；(3)MS+头孢霉素400。

1.2.3芽诱导培养基

可选用十种作为比对案例：(4)MS+6BA 2.0mg/L(单位下同)+KT 2.0+IBA 0.4；(5)MS+6BA 4.0+KT 2.0+IBA 0.4；(6)MS+KT 4.0+IBA 0.4；(7)MS+ZT 0.2+6BA 2.0+KT 2.0+IBA 0.4；(8)MS+ZT 0.4+IBA 0.4；(9)MS+ZT 1.0+IBA 0.4；(10)MS+ZT 0.2+KT 2.0+IBA 0.4；(11)MS+ZT 0.2+6BA 2.0+IBA 0.4；(12)MS+ZT 0.2+IBA 1.0；(13)MS+6BA 0.2+KT 0.2+IBA 1.0。

1.2.4生根培养基：未加激素的MS培养基。

上述所有MS培养基中都添加蔗糖30g/L，pH值5.8-6.0；由于长喙毛茛泽泻是沼泽植物，我们通过控制琼脂添加浓度进行培养基硬度的调整，本实施例以分三个档次的琼脂浓度为例，分别是：5.4g/L的软培养基，强度：1000；5.6g/L的正常培养基；5.8g/L的硬培养基；培养基灭菌条件：115℃，15min，培养基灭完菌后，冷至60℃添加特美汀、头孢霉素等抗生素。

1.2.5培养条件

组织培养室与人工气候室内的温度为25±2℃；光照周期为14小时光照/10小时黑暗，光照强度为2000-2500lux。

表1不同激素组合对茎段不定芽的诱导

表1中的编号是指培养基的编号，表1中的各参数均为接种20天统计，每个组合统计21块外植体，采用t-test方法检测差异度，设定每个外植体有1个不定芽为参照；“*”代表p<0.05，“**”代表p<0.01。

1.3方法

本申请的微繁过程具体如下：

1.3.1外植体灭菌和无菌苗的培养：长喙毛茛泽泻去除淤泥、老的根和叶，用自来水冲洗两小时，浓洗洁精溶液浸泡5分钟，不断震荡，清水冲洗掉洗洁精后移入超净工作台。外植体用升汞(0.1％)消毒8分钟，无菌水清洗5分钟(重复四次)，无菌水冲洗三次，除净升汞。然后将带有嫩叶的茎段移入3种添加不同抗生素的培养基中，一周后判断除菌的效果。然后每2周更换新的培养基，3次后移入无抗生素的MS培养集中，一周后判断除菌的效果。

1.3.2芽诱导培养：超净工作台中，无菌苗的叶切成0.5cm x 0.5cm长度的叶盘，叶柄切成0.5cm长度的叶柄段，带有分生组织的茎纵切0.2cm-0.4cm直径的茎段，把这些茎段移入芽诱导培养基中，组织培养室中培养。20-30天统计芽诱导的情况。

1.3.3生根培养：芽长到1.5-3cm时，把芽切下来移入未加激素的MS培养基中生根。

1.3.4组培苗移栽：组培苗不定根长到约0.5cm时，移入温室，打开盖子，加入适量自来水，隔断空气中的菌类，3天后清除掉根部的培养基，栽植于培养基质(蛭石：腐植土＝1：1)中，20天统计成活率。

1.4统计方法

采用SPSS 22.0软件进行数据统计，显著性差异采用Student's t test。

“*”表示差异显著(p<0.05)；“**”表示差异极显著(p<0.01)。

2.结果

2.1无菌组培苗的获得

我们采用特美汀和头孢霉素来清除长喙毛茛泽泻体内的内生菌，发现两者混合使用(即1.2.2中的培养基(1)效果最好(参见图1)，抗生素中继代3次，然后在无菌的培养基上培养2周后统计，其外植体除菌效率达到85％(153个无菌苗/180个外植体)，无菌苗见图2-5。而其它2个培养基一般在初代培养中全部长出菌斑，无菌苗培养效果没有培养基(1)的好。而不同浓度的琼脂对无菌苗的生长影响较大，生长状态最好的是琼脂浓度为5.4g/L的软培养基。在此培养基中，无菌苗生长状态良好，30天时发现有匍匐茎的发生，以及生长出新的不定芽(图5)。

2.2不定芽的诱导

长喙毛茛泽泻的叶片、叶柄在所有设计的10个培养基中都没有愈伤和器官的发生(图6、图7)，只有带有分生组织的茎段能诱导出不定芽，也没有愈伤的发生(图9、图10)。通过对不同激素配方的培养基(表1)诱导不定芽的数量发现1.2.3中的培养基(4)芽诱导数量最多，平均每个外植体达到2.4个不定芽(图8)。随着促细胞分裂激素(ZT，6BA和KT)总量的增加，抑制不定芽的诱导(表1中培养基(5)、(6)和(7))，培养基中激素含量低时，诱导不定芽(表1中培养基(8)、(9)和(10))的效率较低，培养基中IBA增加时，则能促进不定芽的发生(表1中培养基(11)，(12)和(13))。

2.3生根

不定芽在不同培养基中都有不同程度的生根现象，特别是无菌苗获得过程中组培苗生根情况良好，我们把培养出的不定芽转入生根培养基(MS)中进行培养，生根率达95％以上(图10)。

2.4组培苗移栽

长喙毛茛泽泻种植到基质中，盖上透明盖子保湿，放入人工气候室培养。2天后，植物叶片开始直立并返绿，拿走盖子，打开日光灯，让其正常生长。后期植株生长加速，叶片变绿，长势旺盛。20天统计移栽成活率在95％以上(图11)。

长喙毛茛泽泻的繁殖方式有两种：无性和有性，本申请在获得无菌组培苗时，发现有匍匐茎的发生，并且匍匐茎上有不定根产生，最后形成一连串直线排列的新植株(图3和图5)。这说明可以模拟长喙毛茛泽泻的自然营养繁殖方式，通过组培瓶内培养匍匐茎来微繁长喙毛茛泽泻。

植物激素的浓度和配比对植物组织培养影响很大，细胞分裂素促进芽的分化，生长素促进愈伤组织的形成，不同的植物其适合的浓度配比不同。我们发现带有分生组织的茎能诱导出不定芽，叶片和叶柄诱导出愈伤组织和不定芽(图6和图7)的效果不明显。因此，通过茎段诱导不定芽的微繁方式可以作为长喙毛茛泽泻人工繁殖的方式之一。

本申请通过对无菌苗、培养基硬度、不定芽诱导、生根和移栽等工艺条件的研究，上述各培养方法中，组培瓶内匍匐茎微繁方式和茎段不定芽微繁方式两种微繁方法的诱导效果最佳、最有效，可为该物种的保护提供了有效的技术。

以上内容是结合本发明创造的优选实施方式对所提供技术方案所作的进一步详细说明，不能认定本发明创造具体实施只局限于上述这些说明，对于本发明创造所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明创造的保护范围。