本发明涉及一种牛油果种苗的培养方法。
背景技术：
：牛油果(avocado，alligatorpear)又称鳄梨，学名PerseaamericanaMill.，樟科鳄梨属常绿乔木。原产美洲墨西哥、厄瓜多尔、哥伦比亚等国，中美洲作为粮食食用，欧美多国视其为果中珍品。根据国际粮农组织统计，牛油果在世界范围内50余个国家广泛种植，且是其重要的农业和商业水果。牛油果果实呈梨形、椭球形或近球形，成熟时果皮淡绿、绿或暗绿，采下熟后果皮变成黄绿、乳黄、褐色或暗褐色，后熟时果肉微软，肉色乳白、淡黄或乳黄，肉质细腻，具蛋黄味，略甜。牛油果营养价值高、保健效果好，其脂肪中，80％以上属于不饱和脂肪酸，可以清除血液中的胆固醇。牛油果含糖量低(1％(w/w))，是糖尿病患者的高能食品，被称之为保健水果。牛油果为常绿乔木，种子含油量高，也是良好的绿化树种和油料植物。牛油果对低温的适应能力较强，其耐寒性与柑桔相似，对土壤条件的要求不甚严格，在我国有非常广阔的地区适合种植。目前，在牛油果的种苗培育过程中通常采用实生法、嫁接法和高压法等繁殖方法进行繁殖，但这几种方法繁殖系数较低，不能满足规模化生产对种苗的需求。技术实现要素：本发明的目的在于克服现有技术中不足，通过组织培养的方法培养牛油果种苗，使单个牛油果种子在一个月内形成多株牛油果苗，实现提高繁殖系数，快速获得得到大量的优质牛油果种苗。本发明是这样实现的：一种牛油果种苗的培养方法，包括以下步骤：步骤1，种子表面灭菌：依次采用70％(v/v)乙醇处理0.5-2min，1％(w/w)升汞处理1-5min，无菌水洗；步骤2，切割：横切切除种子1/4-1/2部分，然后剩余部分不再切割，或者继续纵切，将种子大致平分为2-8部分，并使每一部分均保有种子的胚部分；步骤3，将步骤2处理后的种子接种至培养基上进行培养。优选地，步骤1中，采用70％(v/v)乙醇处理1-2min。优选地，步骤1中，采用1％(w/w)升汞处理2-5min。优选地，步骤1中，采用70％(v/v)乙醇处理1min，1％(w/w)升汞处理2min。优选地，步骤3中采用MS培养基。优选地，步骤3中采用添加有0.2mg/L的6-BA的MS培养基。优选地，步骤3中，接种时，将种子底部向下插入培养基，插入深度以培养基上表面刚刚没过种子的胚部分为宜，使种子的胚部分与培养基充分接触。优选地，步骤2中，横切切除种子顶端部分后，继续对种子进行1/2切割、1/4切割、或1/8切割，其中，1/2切割为纵切将种子一分为二，使每部分均保有种子的胚部分；1/4切割为在1/2切割的基础上继续纵切，将种子分为4部分，每部分均保有种子的胚部分；1/8切割，为在1/4切割的基础上继续纵切，将种子分为8部分，每部分均保有种子的胚部分。优选地，在进行步骤1之前，将种子子叶表面凹凸不平的部分削去，使种子表面光滑平整。本发明通过组织培养的方法，对经切割的牛油果种子进行培养，使单个牛油果种子在一个月内形成多株牛油果苗，实现提高繁殖系数，快速获得得到大量的优质牛油果种苗的目的，为我国牛油果产业健康快速的发展提供技术支持和保障。附图说明图1为牛油果种子及牛油果切割方法图示，其中，图A:未剥皮的牛油果种子；图B：剥去种皮的牛油果种子；图C：切去牛油果种子未成熟子叶顶部1/3正视图，红色箭头所指为两片未成熟子叶的中间线，也为1/2切的垂直下刀处；图D：切去牛油果种子未成熟子叶顶部1/3側视图；图E：牛油果1/2切，红箭头所指为牛油果的胚所在地点；图F：牛油果1/4切；图G：牛油果1/8切正视图；图H：牛油果1/8切側视图，红色箭头所指两个1/8牛油果种子没有携带胚组织；图I：1/8牛油果种子放大图，红色箭头所指部分为牛油果胚组织。图2为牛油果种子不同接种方法对胚芽生长的影响，其中，图A:胚芽轴向上，垂直插入培养基，胚芽刚好与培养基接触；图B：牛油果种子水平放入培养基；图C：牛油果种子胚轴反向插入培养基；图D：牛油果种子接种5天后生长情况，胚芽先发育；图E：牛油果种子接种7天后生长情况；图F：牛油果种子接种10天后生长情况，胚根生长；图G：牛油果1/4切侧视图；图H：牛油果1/4切底视图，生长出四根胚根；图I：牛油果1/4切顶视图，生长出四根胚芽。图3为牛油果种子再生苗胚轴及胚根生长及炼苗种植情况，其中，除图C和图F为1/4切割外，其他均为1/8切割，并且图A-C为牛油果种子再生幼苗茎及叶片生长情况，图A为正常生长情况，图B为只留少量子叶的胚芽生长情况，图C为多胚现象；图D-F:分别为图A-C所对应的植株根部生长情况；图G:为炼苗后的植株；图H：为炼苗后栽培三周的生长情况。具体实施方式下面参照附图，结合具体的实施方式对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。1材料与方法1.1材料供试牛油果购自广西省农业科学院。1.2方法1.2.1种子清洗及去皮备用从成熟牛油果果肉中取出牛油果种子后，清洗种子外层附着的果肉；种子自然风干3天左右，搓揉去除附着在种子外表面的种皮(如图1A图和B图所示)；进行组织培养之前，用小刀将种子子叶表面凹凸不平的部分削去，尽量使种子表面光滑平整，以利于种子表面灭菌。1.2.2种子表面灭菌通过70％(v/v)乙醇1-2分钟、1％(w/w)升汞2-3分钟或10％(w/w)次氯酸钠5-10分钟间不同的组合(如表1所示)，实现对牛油果种子表面灭菌的目的。各处理一周后统计污染率和发芽率，每个处理进行三次重复，选出牛油果种子表面灭菌的最优方案。1.2.3牛油果种子的切割方法及接种培养瓶的方法牛油果种子切割方法：横切，切去种子顶端1/3的部分，留下剩余2/3的部分备用；纵切第一刀，沿种子子叶间隙垂直向下切，将种子一分为二，使两部分均保有种子的胚部分；纵切第二刀，将1/2的种子继续分割为1/4，使4份均保有种子的胚胎部分；纵切第三刀，将1/4的种子继续分割为1/8，尽量使8份均保有种子的胚胎部分。检测不同切割方法对牛油果种子产生苗数量的影响(如图1中C-I图所示)。用镊子夹取切好的带胚牛油果种子接种于培养基，按以下三种方法接种如培养瓶中：一，种子底端向下插入培养基，插入深度以培养基上表面刚刚没过种子的胚部分为宜，使种子的胚部分与培养基充分接触(如图2A图所示)；二，种子平躺放在培养基上，使未成熟子叶和胚与培养基充分接触(如图2B图所示)；三，种子未成熟子叶顶端向下插入培养基，插入深度以培养基上表面刚刚没过种子的胚部分为宜，使种子的胚部分与培养基充分接触(如图2C图所示)。观察不同接种方法对出苗率的影响。将接种后的培养瓶放入培养箱，培养方法如下：将种子接种完成之后，将培养瓶转入26℃恒温培养箱中培养，进行暗培养3-7天后，将培养瓶转入16h光照/8h黑暗植物光照培养箱继续培养10-14天。1.2.4不同培养基组成对牛油果种子的发芽率的影响对比1/2MS、MS、MS添加6-BA对牛油果幼苗形态建成的影响。2结果与分析2.1种子表面灭菌对出苗率的影响通过70％(v/v)乙醇30分钟、1分钟、2分钟与1％(w/w)升汞或者10％次氯酸钠处理1分钟、2分钟、5分钟不同的组合(如表1所示)，进行种子表面灭菌，然后用无菌水冲洗3次，每次1分钟，晾干表面水分后备用。沿牛油果种子子叶间隙进行1/2切割(如图1C图所示)，使每半边种子均含有胚组织(如图1G图所示)。子叶底端向下，垂直接种于MS培养基上(如图2A图所示)，每个组合30个样本，16小时光照8小时黑暗，26℃植物光照培养箱培养，一周后统计种子的污染率和发芽率。结果70％(v/v)乙醇与10％(w/w)次氯酸钠的灭菌组合非常容易导致种子表面褐化，影响种子的胚部分萌发，污染率高和发芽率低。而70％(v/v)乙醇与1％(w/w)升汞的灭菌组合种子表面不会出现褐化，污染率和发芽率统计结果如表1所示，70％(v/v)乙醇处理1-2分钟，1％(w/w)升汞处理2-5分钟，无菌水冲洗3次，每次1分钟，接种于MS培养基上，一周后污染率小于3％，发芽率高达80％以上。表1牛油果种子表面消毒结果统计2.2牛油果种子的切割方法及接种方法对出苗率的影响结果如图2所示，不同的牛油果种子接种方式会明显影响种子的发芽速度和苗的生长状态。经过对比试验发现，种子底端向下插入培养基，插入深度以培养基上表面刚刚没过种子的胚部分为宜，使种子的胚部分与培养基充分接触(如图2A图所示)这种接种方法明显优于另外两种接种方法。通过对灭过菌的牛油果种子进行不切割、对半切割、1/4切割和1/8切割后接种到MS培养基中，每个切割方法统计60个样本，观察一周后出胚芽比例，两周后产胚根比例和30天后苗的健壮程度，平均种子产苗数量。结果如表2所示，由表2可知，不切割和1/8切割的种子出苗数量较少，但单个种子平均产苗数量以1/8切割最高。因此，以1/4切割和1/8切割这两种方式占优。表2牛油果种子切割对出苗率的影响不切割对半切割1/4切割1/8切割7天后产胚芽比例33/6046/6053/6037/6014天产胚根比例42/6053/6056/6041/6030天后出苗数量43555641平均每颗种子产苗数量0.631.833.735.472.3牛油果种子再生苗胚轴及胚根生长及炼苗种植情况参照图3，将1/8个牛油果种子的子叶部分完全除去，只留下胚部分，接种于MS培养基上，也能正常形成胚芽和胚根，形成完整的小植株(如图3中A-B所示)，但苗明显弱于1/8切割的种子所产生的苗(图A的苗明显比图B的粗壮，且图A的叶片数目也明显多于图B)，根系数量和根系长度也明显短(如图3中D-E所示，与图A苗所对应的根系图D无论从根的数量还是根的长度明显长于图B苗所对应的根系图E)。同时在牛油果种子发芽过程中也发现多胚现象，其中种子不经切割出现多胚苗的比率为11.67％，经过1/4切割和1/8切割后多胚的现在分别为3.33％和2.5％(如图3中C所示)。牛油果幼苗经过在培养基中30天生长后，叶片展开，根系也比较发达，经拧松培养瓶盖，炼苗3-5天后，可以进行移栽(图3中G所示)。移栽前根部用3％多菌灵沾根，移栽基质选用黑土:椰糠:蛭石＝3:2:1，移栽前期注意遮阴。2.4培养基对牛油果种子的出苗率和出苗质量通过对统计结果分析发现，1/2MS与MS培养基对出苗效率没有显著的差别，但1/2MS培养基中苗普遍弱于MS培养基。同时在MS培养基中添加0.2mg/L6-BA能显著的提高出苗效率和出苗整齐率，如表3所示。表3不同培养基组成对牛油果种子繁殖系数的影响2.5不同切割后再生的牛油果幼苗生长3个月后的情况对比不同切割后再生的牛油果幼苗生长3个月后的情况，见表4。表4不同切割后再生的牛油果幼苗生长3个月后对比统计表植株高度、茎粗和叶片数量统计15株幼苗，主根长度和侧根数量统计10株幼苗。通过分析表明，经过切割后再生的牛油果幼苗的株高、茎粗、叶片数量、主根长度以及侧根条数与不切割的牛油果种子产生的幼苗的相对应指标没有显著差异。实施例1从成熟牛油果果肉中取出牛油果种子后，清洗种子外层附着的果肉；种子自然风干3天左右，搓揉去除附着在种子外表面的种皮；进行组织培养之前，用小刀将种子子叶表面凹凸不平的部分削去，尽量使种子表面光滑平整，以利于种子表面灭菌。对种子表面灭菌，依次采用70％(v/v)乙醇处理1分钟、1％(w/w)升汞处理2分钟，无菌水洗3次，每次1分钟。横切，切去种子顶端1/3的部分，留下剩余2/3的部分备用，纵切第一刀，沿种子子叶间隙垂直向下切，将种子一分为二，使两部分均保有种子的胚部分。用镊子夹取切好的带胚牛油果种子接种于添加有0.2mg/L的6-BA的MS培养基，种子底端向下插入培养基，插入深度以培养基上表面刚刚没过种子的胚部分为宜，使种子的胚部分与培养基充分接触。将接种后的培养瓶放入培养箱，培养方法如下：将种子接种完成之后，将培养瓶转入26℃恒温培养箱中培养，进行暗培养3-7天后，将培养瓶转入16h光照/8h黑暗植物光照培养箱继续培养。牛油果幼苗经过在培养基中30天生长后，叶片展开，根系也比较发达，经拧松培养瓶盖，炼苗3-5天后，可以进行移栽(图3中G所示)。移栽前根部用3％多菌灵沾根，移栽基质选用黑土:椰糠:蛭石＝3:2:1，移栽前期注意遮阴。实施例2从成熟牛油果果肉中取出牛油果种子后，清洗种子外层附着的果肉；种子自然风干3天左右，搓揉去除附着在种子外表面的种皮；进行组织培养之前，用小刀将种子子叶表面凹凸不平的部分削去，尽量使种子表面光滑平整，以利于种子表面灭菌。对种子表面灭菌，依次采用70％(v/v)乙醇处理2分钟、1％(w/w)升汞处理2分钟，无菌水洗3次，每次1分钟。横切，切去种子顶端1/3的部分，留下剩余2/3的部分备用；纵切第一刀，沿种子子叶间隙垂直向下切，将种子一分为二，使两部分均保有种子的胚部分，然后纵切第二刀，将1/2的种子继续分割为1/4，使4份均保有种子的胚胎部分。用镊子夹取切好的带胚牛油果种子接种于MS培养基，种子底端向下插入培养基，插入深度以培养基上表面刚刚没过种子的胚部分为宜，使种子的胚部分与培养基充分接触。将接种后的培养瓶放入培养箱，培养方法如下：将种子接种完成之后，将培养瓶转入26℃恒温培养箱中培养，进行暗培养3-7天后，将培养瓶转入16h光照/8h黑暗植物光照培养箱继续培养10-14天。实施例3从成熟牛油果果肉中取出牛油果种子后，清洗种子外层附着的果肉；种子自然风干3天左右，搓揉去除附着在种子外表面的种皮；进行组织培养之前，用小刀将种子子叶表面凹凸不平的部分削去，尽量使种子表面光滑平整，以利于种子表面灭菌。对种子表面灭菌，依次采用70％(v/v)乙醇处理1分钟、1％(w/w)升汞处理5分钟，无菌水洗3次，每次1分钟。横切，切去种子顶端1/3的部分，留下剩余2/3的部分备用；纵切第一刀，沿种子子叶间隙垂直向下切，将种子一分为二，使两部分均保有种子的胚部分，然后纵切第二刀，将1/2的种子继续分割为1/4，使4份均保有种子的胚胎部分，再纵切第三刀，将1/4的种子继续分割为1/8，使8份均保有种子的胚胎部分。用镊子夹取切好的带胚牛油果种子接种于添加有0.2mg/L的6-BA的MS培养基，种子底端向下插入培养基，插入深度以培养基上表面刚刚没过种子的胚部分为宜，使种子的胚部分与培养基充分接触。将接种后的培养瓶放入培养箱，培养方法如下：将种子接种完成之后，将培养瓶转入26℃恒温培养箱中培养，进行暗培养3-7天后，将培养瓶转入16h光照/8h黑暗植物光照培养箱继续培养10-14天。以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。当前第1页1 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