一种利用茶树内生草螺菌促进茶叶富硒的应用技术的制作方法

本发明涉及的是利用茶树内生草螺菌促进茶叶中有机硒富集技术，特别是一种应用茶树内生草螺菌转化植物从土壤中吸收的有毒硒酸盐/亚硒酸盐并促进茶叶中有机硒富集的方法。

背景技术：

硒是人和动物必需的微量元素之一，与机体的抗氧化能力、免疫功能、抗病毒、抗癌作用等有着十分密切的关系。土壤中的硒主要是以seo4^2-和seo3^2-的形式存在并溶于水，可通过根部吸收直接进入植物体内并转化为有机硒。有机硒才能被人体或动物有效利用。但是，高浓度的硒酸盐对动、植物有明显的毒性。鉴于硒具有高效抗氧化、抗癌、中和重金属毒性、高吸收利用率等独特的生物学效应，在家养动物生产、医药、保健品方面具有广泛的应用前景。在这种背景下，硒茶作为保健饮料越来越受到人们的青睐。可是，我国74%的地区缺硒或低硒，只有少数地区为富硒区，如湖北恩施、贵州开阳、陕西紫阳、湖南桃源和新田、广西永福、青海平安等。除了上述地区种植的茶叶可能含硒外，其它地区的茶叶中都不含硒。既使在富硒地区，周边含硒量低的区域种植的茶叶含硒量仍极低。为了提高茶叶中硒的含量，人们通常使用硒肥料或叶面喷洒亚硒酸钠。长期使用硒肥或叶面喷洒亚硒酸钠可能导致土壤、水体的硒污染。叶面喷洒亚硒酸钠还可能导致亚硒酸钠直接进入茶叶内，未还原的se⁴⁺仍具有较强的生物毒性。为了减少环境污染、加快茶树对土壤或硒肥中硒酸盐的转化利用和促进茶叶中硒的富集，我们通过扦插苗繁殖，将茶树内生草螺菌引入茶树体内并与之共生以促进茶叶中有机硒富集，并建立了一种应用茶树内生草螺菌转化植物从土壤中吸收的硒酸盐以促进茶叶中有机硒富集的新技术。

茶树内生草螺菌是一种茶树共生专一性强的内生细菌，无致病性。文献“两株茶树内生草螺菌的微生物学特性”（王婷等，微生物学报2014第4期，2014.04.04，p424-432）详细叙述了茶树内生草螺菌的微生物学特性，但未涉及茶树内生草螺菌的应用。近期我们发现茶树内生草螺菌拥有完整的硒代谢途径，具有强的硒还原能力。在硒酸盐的刺激下，细菌能高效表达硒酶、硒醚水二潋酶、硫氧还原蛋白还原酶、谷胱甘肽s-转移酶、葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶。这些酶能有效地催化硒酸盐/亚硒酸盐的还原，产生的中间产物如硒化氢、硒磷酸、l-硒代半胱氨酸、r-s-谷光甘肽、乃至终产物硒蛋白可供茶树直接利用，促进茶叶中有机硒的富集。由于茶树内生草螺菌具有强的硒还原能力，定殖后的茶树内生草螺菌还能有效降低根部吸收的硒酸盐对茶树的生理毒害，有利于茶树体内硒的富集和向上转移。

技术实现要素：

目前，生产中为了提高茶叶中硒的含量，通常使用硒肥料或叶面喷洒亚硒酸钠，长期使用硒肥或叶面喷洒亚硒酸钠可能导致土壤、水体的硒污染；叶面喷洒亚硒酸钠还可能导致亚硒酸钠直接进入茶叶内，未还原的se⁴⁺仍具有较强的生物毒性。针对现有技术的不足，发明人提出一种利用茶树内生草螺菌与茶树共生促进茶叶中有机硒富集的方法，使用茶树内生草螺菌与茶树的扦插杆共培养，使草螺菌通过切口进入扦插杆内并定殖，茶树扦插苗成活后移栽在含硒土壤或施用硒肥的土壤里，定殖的茶树内生草螺菌有效地促进茶树对吸收进入体内的硒酸盐的转化利用，提高茶叶中有机硒的含量。

一种利用茶树内生草螺菌促进茶叶富硒的应用技术，其特征在于：通过茶树扦插条在草螺菌培养液中的浸泡，将草螺菌定殖于茶苗体内，使茶树从土壤中吸收的硒酸盐或亚硒酸盐转化成无毒的零价单质硒、有机硒或硒蛋白，实现茶叶中有机硒的富集；所述的该应用技术包括如下的步骤：

（1）茶树内生草螺菌的活化与培养

按文献“两株茶树内生草螺菌的微生物学特性”（王婷等，微生物学报2014第4期，2014.04.04，p424-432）的方法活化与培养细菌。取-80°c保存的茶树内生草螺菌菌种，接种5ml营养肉汤培养基(10g胰蛋白胨，3g牛肉粉，5gnacl，10μg/ml壮观霉素，5μg/ml氨苄青霉素，加水至1000ml)，每分钟150转摇动，28°c培养过夜。将活化后的菌液以1:100的体积比接入新鲜的lb液体培养基(10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10gnacl，10μg/ml壮观霉素，5μg/ml氨苄青霉素，加水至1000ml，ph7.2-7.4)中，摇床转速每分钟250转，温度为37°c培养至od600=0.8-1.0，并加入1%甘油备用。

（2）茶树内生草螺菌处理与扦插苗繁殖

按常规方法选择生长健壮的茶树当年生枝条作扦插条，扦插条长7-15厘米，顶部在侧芽上方平切，保留顶部1-2片叶，基部在侧芽下方平切。然后用水将上述细菌培养液按1:1体积比稀释，放入浸泡盆内，再放入扦插条。扦插条顶部朝上，不让浸泡液淹没扦插条顶部。常温浸泡扦插条1-3小时，让草螺菌充分接触扦插条下端切口处，并通过虹吸作用促进草螺菌进入扦插条内。浸泡后在苗床进行扦插，扦插后按常规苗莆田间管理方法进行管理。

（3）扦插苗移栽

待上述处理过的扦插苗成活后，移栽至含硒或施有硒肥的花缸或大田茶园土壤里，移栽后的茶苗管理按常规田间管理方法进行管理。

（4）茶树硒含量的检测

首先将土样或收集的茶树样本编号并放置在干净台面上，去除石块等杂物，用流动的自来水洗净植株，再用去离子水清洗3次。茶树样本则按根、茎、叶3部分分割，置于干净的玻璃容器内并放入70°c恒温烘箱中烘干。各类样品经研钵研磨粉碎，过100目筛后装袋备用。

准确称取1克样品,置于玻璃消化管中，沿壁准确缓慢加入10ml硝酸-高氯酸(hno3:hclo4=4:1)混合液，并轻轻摇晃分散样品。对照则取1ml超纯水于消化管内，同样加入10ml硝酸-高氯酸混合液，轻轻摇晃均匀。管口盖上弯颈小漏斗，放置过夜。然后将消化管置于铁丝笼中，放入温度为180℃的油锅中。待消化管中棕红色气体放出后，不时晃动铁丝笼和消化管，保持受热均匀。消煮60min左右后移出消化管。当消化管的温度完全降至室温后，打开弯颈小漏斗，准确加入10ml盐酸溶液(hcl:超纯水=1:1)，轻轻摇晃混合均匀。将消化管内的消化物倒入50ml容量瓶中，并用超纯水少量多次洗净消化管内部及小漏斗,收集洗涤液并合并至容量瓶中,最后用超纯水定容至50ml，静置过夜。

从50ml容量瓶中取5.0ml澄清上层液体至干净的25ml容量瓶中，准确加入2.5ml盐酸溶液(hcl:超纯水=1:1)和1.0ml10%铁氰化钾溶液，用超纯水定容至25ml，并混合均匀。此为待测溶液。标准曲线溶液的配制:先取1.0ml0.1mg/l硒标准液，用超纯水定容至100ml。再按比例取不同体积的硒溶液于25ml比色管中并用超纯定容至10ml，硒的终浓度分别为0.0μg/l、4.0μg/l、8.0μg/l、12.0μg/l、16.0μg/l、20.0μg/l。再分别加2.5ml盐酸溶液(hcl:超纯水=1:1)和1.0ml铁氰化钾溶液，混合均匀即为标准曲线待测液。所有处理后的样品均在带硒空心阴极灯的原子荧光光谱仪上测定,获得数据并汇制标准曲线。然后根据待测样品的读数减去对照的读数的差值,在标准曲线上求得待测样品的含硒值,再乘以稀释倍数即为待测样品中硒含量。每个样品测量重复三次。

相对现有技术，本发明具有独特的优点：

1、茶树内生草螺菌是茶树专一性强的内生细菌，与茶树互惠共生无致病性。它具有强的还原能力,能有效地将硒酸盐还原成亚硒酸盐，并进一步还原成零价单质硒（se⁰）或合成有机硒。本发明充分利用了茶树内生草螺菌这一生物学特性，将茶树内生草螺菌导入茶苗体内定殖,在茶树体内代谢转化硒酸盐或亚硒酸盐,一方面降低根部吸收的硒酸盐对茶树的生理毒害,另一方面向茶树提供硒代谢产物供茶树直接利用，促进茶叶中有机硒的富集，利用这一技术,无论在低硒、高硒土壤或使用硒肥种植的茶树，茶叶中硒含量可提高2-3倍。

2、本发明结合茶树栽培技术,通过简单的浸泡方法将茶树内生草螺菌导入茶苗后,草螺菌在茶苗内定殖且与茶树共生,随着茶树的生长一直保留在植株体内,无需反复接种，极大的节省劳动力。

3、整个技术流程是根据目前大田茶树栽培设计的,易于放大生产规模，操作简单易学，无需特殊管理，茶叶中硒富集效果显著。

附图说明

图1为本发明实施例1中含硒土壤(硒含量为0.622mg/kg)种植茶苗的实验结果。图1-a为直接注射接种茶树内生草螺菌后茶树根、茎、叶中的硒含量；图1-b为茶树内生草螺菌处理扦插苗后茶树根、茎、叶中的硒含量，与对照比较，茶叶中硒含量提高2-3倍。

图2为本发明实施例2中含硒土壤(硒含量为1.5mg/kg)种植茶苗的实验结果。图2-a直接注射接种茶树内生草螺菌后茶树根、茎、叶中的硒含量；图2-b茶树内生草螺菌处理扦插苗后茶树根、茎、叶中的硒含量，与对照比较，茶叶中硒含量提高2倍以上。

图3为本发明实施例3中含硒土壤(硒含量为3.5mg/kg)种植茶苗的实验结果。图3-a直接注射接种茶树内生草螺菌后茶树根、茎、叶中的硒含量；图3-b茶树内生草螺菌处理扦插苗后茶树根、茎、叶中的硒含量，与对照比较，茶叶中硒含量提高2倍以上。

具体实施方式

以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步作描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。

实施例1

取5公斤恩施含硒土壤，硒含量为0.622mg/kg，装入花盆（盆口直径28cm,盆底直径25cm，高27cm）并栽入二年生槠叶齐茶苗,每盆5株,置于自然环境条件下生长。待成活后长出3片新生叶,在茎的中下端(距土面3-5cm处)注射接种培养好的茶树内生草螺菌，接种量为200μl，细菌含量为1.02×10⁸cfu/ml。对照组则注射等体积的pbs（磷酸缓冲液ph7.2）。注射后伤口用无菌棉球封住。实验组和对照组各为20盆，每组共计100株。接种后让其继续生长。在30、60、90和150天分别取样，每组每次随机取出25株，分根、茎、叶三部分收集样本并检测硒含量，结果见图1-a。

使用无硒咸宁土壤5公斤，研细后与含3.11mg硒酸盐的水溶液混合拌匀并装盆,停放一周后检测土壤硒含量为0.622mg/kg。移栽茶树内生草螺菌处理后成活的一年生扦插苗，并置于自然环境条件下生长。对照组则移栽未经茶树内生草螺菌处理的同龄茶树扦插苗。在成活长出新叶后30、60、90和150天分别取样，每组每次随机取出25株，分根、茎、叶三部分收集样本并检测硒含量，结果见图1-b。

实施例2

在5公斤恩施含硒土壤(硒含量为0.622mg/kg)中加入4.39mg硒酸盐使土壤硒含量为1.5mg/kg。装盆后栽入二年生槠叶齐茶苗,每盆5株,置于自然环境条件下生长。待成活后长出3片新生叶,在茎的中下端(距土面3-5cm处)注射接种培养好的茶树内生草螺菌，接种量为200μl，细菌含量为1.02×10⁸cfu/ml。对照组则注射等体积的pbs（磷酸缓冲液ph7.2）。注射后伤口用无菌棉球封住。实验组和对照组各为20盆，每组共计100株。接种后让其继续生长。在30、60、90和150天分别取样，每组每次随机取出25株，分根、茎、叶三部分收集样本并检测硒含量，结果见图2-a。

使用无硒咸宁土壤5公斤，研细后加入7.5mg硒酸盐,使土壤硒含量为1.5mg/kg。装盆后移栽茶树内生草螺菌处理后成活的一年生扦插苗，并置于自然环境条件下生长。对照组则移栽未经茶树内生草螺菌处理的同龄茶树扦插苗。在成活长出新叶后30、60、90和150天分别取样，每组每次随机取出25株，分根、茎、叶三部分收集样本并检测硒含量，结果见图2-b。

实施例3

在5公斤恩施含硒土壤(硒含量为0.622mg/kg)中加入14.39mg硒酸盐使土壤硒含量为3.5mg/kg。装盆后栽入二年生槠叶齐茶苗,每盆5株,置于自然环境条件下生长。待成活后长出3片新生叶,在茎的中下端(距土面3-5cm处)注射接种培养好的茶树内生草螺菌，接种量为200μl，细菌含量为1.02×10⁸cfu/ml。对照组则注射等体积的pbs（磷酸缓冲液ph7.2）。注射后伤口用无菌棉球封住。实验组和对照组各为20盆，每组共计100株。接种后让其继续生长。在30、60、90和150天分别取样，每组每次随机取出25株，分根、茎、叶三部分收集样本并检测硒含量，结果见图3-a。

使用无硒咸宁土壤5公斤，研细后加入17.5mg硒酸盐,使土壤硒含量为3.5mg/kg。装盆后移栽茶树内生草螺菌处理后成活的一年生扦插苗，并置于自然环境条件下生长。对照组则移栽未经茶树内生草螺菌处理的同龄茶树扦插苗。在成活长出新叶后30、60、90和150天分别取样，每组每次随机取出25株，分根、茎、叶三部分收集样本并检测硒含量，结果见图3-b。