本发明涉及一种促进忍冬花蕾中次生代谢产物积累的方法，具体涉及一种利用真菌促进忍冬花蕾中绿原酸积累的方法。
背景技术：
随着“回归自然”潮流的涌起，传统天然植物药越来越受到人们的青睐。金银花源于忍冬科植物忍冬lonicerajaponicathunb.的干燥花蕾或带初开的花，性寒，味甘，具有清热解毒、凉散风热之功效，是中医临床常用药，据统计约1/3的中药方剂中用到了金银花，而且在双黄连、银翘解毒丸、银黄口服液等中成药中广泛应用，特别在sars和禽流感等重大疫情防治中发挥了巨大作用，被誉为“中药中的青霉素”。目前国内外市场对金银花的需求量日益增加，对药材质量的要求也越来越高。药用植物体内的次生代谢物质通常是中药材发挥临床疗效的重要物质基础，2015版《中国药典》中规定忍冬体内的绿原酸含量被作为衡量金银花药材品质的重要指标之一，因此采取有效措施促进忍冬体内绿原酸的积累对于提高金银花药材的质量越来越重要。
茶藨子叶状层菌phylloporiaribis(schumach.:fr.)ryvarden是来源于忍冬植株上的一种真菌，该菌主产于山东平邑，寄生于忍冬植株老干或裸露的根部，其子实体被称为“银花蛾子”。该真菌是一种药用真菌，在当地具有悠久的历史，2002年载入《山东省中药材标准》，其含有三萜类、甾醇类、多糖类和苯乙烯基吡喃酮类等有效成分，具有清热解毒、消肿利咽、降血糖和抗肿瘤等作用。目前，对茶藨子叶状层菌的研究较少，主要是将其制成食品或药用原料，其他方面的用途未见报道。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种利用真菌促进忍冬花蕾中绿原酸积累的方法，该方法是在忍冬植株上接种茶藨子叶状层菌和木霉菌，以提高忍冬花蕾中次生代谢产物—绿原酸的含量，该方法对提高金银花药材的品质具有重要意义。
茶藨子叶状层菌phylloporiaribis(schumach.:fr.)ryvarden是生长于忍冬植株上的一种原始野生真菌，经过研究发现，原始野生状态下忍冬植株上生长的茶藨子叶状层菌对忍冬花蕾中次生代谢物质的积累未产生显著影响，这可能与忍冬和茶藨子叶状层菌长期共存维持在相对的物质与生态的平衡有关。发明人经过研究，将茶藨子叶状层菌与木霉菌一起共同接种在忍冬植株上，这两种菌共同接种能促进忍冬花蕾中次生代谢产物的积累，从而使忍冬花蕾中次生代谢物质的含量有了很大的提升。
本发明具体技术方案如下：
一种利用真菌促进忍冬花蕾中绿原酸积累的方法，该方法是：采用扦插育苗法栽培忍冬，并且在扦插过程中对忍冬枝条进行真菌接种，以提高忍冬花蕾中绿原酸的含量；所述真菌为茶藨子叶状层菌和木霉菌。
本发明通过在扦插过程中对忍冬枝条进行真菌接种的方式来提高忍冬花蕾中次生代谢产物绿原酸的积累，从而提高其含量。本发明扦插育苗的方法包括以下步骤：
（1）扦插的前2天用质量浓度为1/3000的多菌灵水溶液对基质和插床进行浇灌，直至基质和插床全部湿透；
（2）然后将基质和插床在太阳下暴晒2天，将基质放于插床内；
（3）扦插前2小时用真菌菌液对基质和插床进行浇灌，直至基质和插床全部浇透，所述真菌菌液为茶藨子叶状层菌菌液和木霉菌菌液的混合液；
（4）将忍冬扦插枝条灭菌消毒，置于真菌菌液中浸泡10-12h，取出后蘸取生根粉，然后进行扦插，扦插后浇一次透水；
（5）扦插后，对忍冬扦插枝条进行扦插育苗管理，直至扦插苗长到符合移栽或出圃要求，然后将符合要求的扦插苗进行移栽和苗期管理（即田间管理），植株现蕾后15-20天即可采摘花蕾。
本发明方法中，采用真菌菌液对忍冬植株进行接种，所述真菌菌液为茶藨子叶状层菌菌液和木霉菌菌液的混合液。其中，所述茶藨子叶状层菌菌液可以以野生状态下忍冬植株上生长的茶藨子叶状层菌phylloporiaribis(schumach.:fr.)ryvarden子实体为菌种培养得到，也可以以保藏号为cgmccno1195的茶藨子叶状层菌phylloporiaribis(schumach.:fr.)ryvarden为菌种培养得到；所述木霉菌菌液可以以木霉菌为菌种培养得到，所述木霉菌可以为绿色木霉(trichodermaviride)或哈茨木霉(trichodermaharziamum)。绿色木霉或哈茨木霉可以从中国普通微生物菌种保藏管理中心或中国典型培养物保藏中心获取，例如保藏号为cgmccno3.5488或cgmccno3.5492的哈茨木霉、保藏号为cctccno.m2010119的哈茨木霉、保藏号为cgmccno.7035的绿色木霉(trichodermaviride)juwe1002，也可以从市场中购买。
进一步的，本发明所用的茶藨子叶状层菌菌液的制备方法为：
a.将茶藨子叶状层菌phylloporiaribis(schumach.:fr.)ryvarden接种到斜面培养基上，在29℃培养5-7天；所述斜面培养基由以下重量百分含量的组分组成：土豆20%、琼脂1.5%、葡萄糖2%、磷酸二氢钾0.2%、硫酸镁0.05%、维生素1×10-3%，水余量；
b.将斜面培养后生长的较好的茶藨子叶状层菌菌丝团接种到液体培养基中，在29℃、150rpm的条件下培养5-6天，得茶藨子叶状层菌菌液，每1000ml液体培养基每瓶接种5-8个菌丝团；所述液体培养基由以下重量百分含量的组分组成：土豆30%、葡萄糖2%、琼脂1.4%、麦芽汁（10bx）10%、蔗糖1.5%、蛋白胨0.2%、麸皮4%、磷酸二氢钾0.05%、硫酸镁0.025%、水余量。
进一步的，本发明所用的木霉菌菌液的制备方法为：
（1）将木霉菌接种到斜面培养基上，在25-30℃恒温培养2-3天；所述斜面培养基由以下重量百分含量的组分组成：土豆20%、葡萄糖2%、琼脂1.6%、蛋白胨0.2%、磷酸二氢钾0.2%、七水硫酸镁0.1%；
（2）将斜面培养所得的菌种按照5-10wt%的接种量接种到液体培养基中，在25-30℃、150-200r/min的摇床上培养6-7天，得木霉菌菌液；所述液体培养基由以下重量百分含量的组分组成：土豆20%、蔗糖1%、葡萄糖1%、无水乙酸钠0.18%、七水硫酸镁0.54%、蛋白胨0.06%、氯化锰0.02%、消泡剂0.005%、水余量。
本发明上述真菌菌液中，茶藨子叶状层菌菌液和木霉菌菌液的体积比为2-8:1，优选为5:1。所述茶藨子叶状层菌菌液和木霉菌菌液是按照上述方法得到的菌液，将这两者菌液按照规定的体积比混合，即可得到真菌菌液。
上述扦插方法中，步骤（1）中所用基质为河砂、蛭石、腐殖土按质量比2∶1∶1混合所得。
上述扦插方法中，忍冬扦插枝条的制备方法如下：选择阴天上午9:00左右采集扦插枝条，剪取两年生4mm粗的生长健壮、无病虫害的嫩枝或硬枝，剪成长30cm左右的插条，每个插条上有6-8个节，每个节位的叶片各自剪掉1/2叶子，扦插穗条下端切口要平整为斜口，50条扎成1捆，用喷雾器将枝条喷湿，待枝条全部湿润后，将其放进泡沫隔热箱子里，上面再盖一层湿毛巾保湿，盖上盖子，等待扦插。
上述扦插方法中，步骤（4）中忍冬扦插枝条用0.06wt%的高锰酸钾水溶液浸泡10-12h，进行灭菌消毒。灭菌消毒后将忍冬扦插枝条在真菌菌液中浸泡，以使尽量多的真菌接种到扦插枝条中，浸泡后蘸取生根粉即可进行扦插。所述生根粉是本领域常用的促进枝条生根的处理剂，可以自行配置，也可以从市场上购买。
上述扦插方法中，扦插时，将扦插枝条的斜口端垂直插入育苗床内，下端插进基质8-12cm，扦插密度为0.5×0.25cm。扦插后要踩紧压实，浇透1次水。之后及时进行浇水、施肥等常规管理，一般每隔5天浇1次水，7-15天能生根并萌芽开始生长，成活后即可进行移栽、常规田间管理。
本发明方法中，扦插枝条满足移栽条件后，选择土质疏松、肥沃、排水良好的砂质壤土和灌溉方便、有水源的地方进行移栽。选地后深翻土壤30cm以上，打碎土块，整平耙细，施足基肥。然后做成宽1.3m的高畦或高垄进行栽植。栽植地可利用荒坡、地边、沟旁、房前屋后等零星地块，一般于早春萌发前或秋冬季休眠期进行移栽。移栽时，在整好的栽植地上按行距150cm、株距120cm挖穴，宽深各30-40cm，一般每hm2栽植3750～4200穴。每穴施入土杂肥5kg与底土拌匀，然后每穴栽壮苗1株，填细土压紧、踏实，浇透定根水，然后每隔30天浇水一次，并进行常规田间管理，现蕾后15-20天即可采摘。采摘宜在每天的上午，采摘时勿夹入枝叶杂质，宜轻拿轻放，采后的鲜花应及时放置40-50℃低温烘干待检测。
本发明用真菌对忍冬植株进行处理，使忍冬生长过程中伴有真菌的生长，真菌生长在忍冬的茎基部位，真菌的生长能够促进忍冬花蕾中次生代谢产物——绿原酸的积累，提高金银花的质量。本发明方法原料来源广泛、操作方便，易于实施，对生产上提高金银花质量具有重要意义。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行进一步说明，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限制。
实施例1
采用以下方法对忍冬进行栽培，采取花蕾：
1、忍冬扦插枝条的制备
4月上旬，选择阴天上午9:00左右采集扦插枝条，选取两年生4mm粗的生长健壮、无病虫害无、无干缩、无破皮损伤的健壮嫩枝或硬枝，剪成长为30cm左右的插条，每个插条上有6-8个节，每个节位的叶片各自剪掉1/2叶子，扦插穗条下端切口要平整为斜口。将剪取的枝条每50条扎成1捆，用喷雾器将枝条喷湿，待枝条全部湿润后，将其放进泡沫隔热箱子里，上面再盖一层湿毛巾保湿，盖上盖子，等待扦插。
、真菌菌液的制备
2.1制备茶藨子叶状层菌菌液
a.培养基的制备
斜面培养基的制备：在市场上购买土豆，削去外皮，切成1cm见方小块，将土豆块加入水中，121℃灭菌后煮沸30min（注意火力的控制，可适当补水），用纱布过滤取滤液。在滤液中加入琼脂、葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、维生素，用玻璃棒不断搅拌，加热溶解，补足水分，调整ph值至6，装入试管，灭菌后冷却，制成斜面培养基；斜面培养基配方为（wt%）：土豆20%、琼脂1.5%、葡萄糖2%、磷酸二氢钾0.2%、硫酸镁0.05%、维生素1×10-3%，水余量。
液体培养基的制备：在市场上购买土豆，削去外皮，切成1cm见方小块，将土豆块加入水中，121℃灭菌后煮沸30min（注意火力的控制，可适当补水），用纱布过滤取滤液。在滤液中加入葡萄糖、琼脂、麦芽汁（10bx）、蔗糖、蛋白胨、麸皮、磷酸二氢钾、硫酸镁，补足水分，调整ph值至6，灭菌，得液体培养基；液体培养基配方为（wt%）：土豆30%、葡萄糖2%，琼脂1.4%，麦芽汁（10bx）10%，蔗糖1.5%，蛋白胨0.2%，麸皮4%，磷酸二氢钾0.05%、硫酸镁0.025%，水余量。
b.茶藨子叶状层菌菌液的制备
接种：接种工作在净化工作台上进行。当以野生状态下忍冬植株上生长的茶藨子叶状层菌phylloporiaribis(schumach.:fr.)ryvarden子实体为菌种时，接种前先用紫外灯对子实体消毒40min，在无菌状态下将子实体边缘正在生长的部分组织接种于含斜面培养基的试管中，在29℃培养5-7天。当以保藏号为cgmccno1195的茶藨子叶状层菌phylloporiaribis(schumach.:fr.)ryvarden为菌种时，直接将该菌种接种于含斜面培养基的试管中，在29℃培养5-7天。
液体培养：取上述斜面试管中固体培养生长情况较好的茶藨子叶状层菌菌丝团进行接种，接种到液体培养基中，注意剔除底部含有琼脂的斜面培养基，菌丝团的直径大约为1-2mm，尽量使所取菌丝团的大小保持一致，每1000ml液体培养基接种8个菌丝团，接种后将三角瓶置于29℃、在转速150rpm的条件下培养6天，得茶藨子叶状层菌菌液。
2.2制备木霉菌菌液
a.培养基的制备
斜面培养基的制备：在市场上购买土豆，削去外皮，切成1cm见方小块，将土豆块加入水中，121℃灭菌后煮沸30min（注意火力的控制，可适当补水），用纱布过滤取滤液。在滤液中加入葡萄糖、琼脂、蛋白胨、磷酸二氢钾、七水硫酸镁，用玻璃棒不断搅拌，加热溶解，补足水分，调整ph值至6，装入试管，灭菌后冷却，制成斜面培养基；斜面培养基配方为（wt%）：土豆20%、葡萄糖2%、琼脂1.6%、蛋白胨0.2%、磷酸二氢钾0.2%、七水硫酸镁0.1%。
液体培养基的制备：在市场上购买土豆，削去外皮，切成1cm见方小块，将土豆块加入水中，121℃灭菌后煮沸30min（注意火力的控制，可适当补水），用纱布过滤取滤液。在滤液中加入蔗糖、葡萄糖、无水乙酸钠、七水硫酸镁、蛋白胨、氯化锰、消泡剂，补足水分，调整ph至6，灭菌，得液体培养基。液体培养基配方为（wt%）：土豆20%、蔗糖1%、葡萄糖1%、无水乙酸钠0.18%、七水硫酸镁0.54%、蛋白胨0.06%、氯化锰0.02%、消泡剂0.005%、水余量。
b.木霉菌菌液的制备
接种：接种工作在净化工作台上进行。以保藏号为cctccno.m2010119的哈茨木霉(trichodermaharziamum)为菌种，直接将该菌种接种于含斜面培养基的试管中，在30℃培养2-3天。
液体培养：将斜面培养所得的菌种按照8wt%的接种量接种到液体培养基中，在30℃、150-200r/min的摇床上培养7天，得木霉菌菌液。
2.3制备真菌菌液
取上述得到的茶藨子叶状层菌菌液和木霉菌菌液，将它们按照5:1的体积比混合均匀，即得真菌菌液。
、忍冬扦插育苗床的准备
忍冬扦插育插床采用长2m，宽1m，高0.25m的底部具有漏水孔的塑料容器，内装的培养基质为河砂、蛭石、腐殖土，质量比为2∶1∶1混合而成。扦插的前2天用质量浓度为1/3000的多菌灵水溶液对基质和插床进行浇灌，直至基质和插床全部湿透。然后将基质和插床在太阳下暴晒2天，将基质放于插床内。扦插前2小时用真菌菌液进行浇灌，直至基质和插床全部浇透。
、忍冬枝条的扦插
将忍冬扦插枝条放入0.06wt%的高锰酸钾水溶液中，浸泡10-12h，进行灭菌消毒。然后置于真菌菌液（茶藨子叶状层菌菌液和木霉菌菌液体积比为5:1）中浸泡12h，取出后蘸取生根粉，速沾20s，然后进行扦插。扦插时，将扦插枝条的斜口端垂直插入育苗床内，下端插进基质8-12cm，扦插密度一般为0.5×0.25cm。扦插后要踩紧压实，浇透1次水。之后及时进行浇水、施肥等常规管理，一般每隔5天浇1次水，7-15天能生根并萌芽开始生长，成活后即可进行移栽。
、移栽过程
扦插枝条满足移栽条件后，选择地选择土质疏松、肥沃、排水良好的砂质壤土和灌溉方便、有水源的地方进行移栽。选地后深翻土壤30cm以上，打碎土块，整平耙细，施足基肥。然后做成宽1.3m的高畦或高垄进行栽植。栽植地可利用荒坡、地边、沟旁、房前屋后零星地块，一般于早春萌发前或秋冬季休眠期进行移栽。移栽时，在整好的栽植地上按行距150cm、株距120cm挖穴，宽深各30-40cm，一般每hm2栽植3750～4200穴。每穴施入土杂肥5kg与底土拌匀，然后每穴栽壮苗1株，填细土压紧、踏实，浇透定根水，然后每隔30天浇水一次，并进行常规田间管理。带植株长至现蕾后15-20天即可采摘。采摘宜在每天的上午，采摘时勿夹入枝叶杂质，宜轻拿轻放，采后的鲜花应及时放置40-50℃低温烘干待检测。
实施例2
按照实施例1的方法对忍冬进行栽培，采集花蕾，不同的是：所用木霉菌菌种为保藏号为cgmccno.7035的绿色木霉(trichodermaviride)juwe1002。
实施例3
按照实施例1的方法对忍冬进行栽培，采集花蕾，不同的是：所用木霉菌菌种为美国典型培养物保藏中心保藏的哈茨木霉(trichodermaharziamum)ys-jz0386（购自上海研生实业有限公司）。
实施例4
按照实施例1的方法对忍冬进行栽培，采集花蕾，不同的是：茶藨子叶状层菌菌液和木霉菌菌液的体积比为2:1。
实施例5
按照实施例1的方法对忍冬进行栽培，采集花蕾，不同的是：茶藨子叶状层菌菌液和木霉菌菌液的体积比为8:1。
对比例1
按照实施例1的方法对忍冬进行栽培，采集花蕾，不同的是：所用真菌菌液为单一的茶藨子叶状层菌菌液。
对比例2
按照实施例1的方法对忍冬进行栽培，采集花蕾，不同的是：所用真菌菌液为单一的木霉菌菌液。
对比例3
按照实施例1的方法对忍冬进行栽培，采集花蕾，不同的是：所用真菌菌液是体积比为5:1的茶藨子叶状层菌菌液和巨大芽孢杆菌菌液的混合液。
巨大芽孢杆菌菌液的制备方法为：
按照1wt%的接种量将巨大芽孢杆菌（购自扬州市海诚生物技术有限公司）接种到液体培养基中，调整温度为35-38℃，无菌风量控制在90-100m3/h，发酵2天。液体培养基配方为：玉米粉1.2%、酵母粉0.3%、豆饼粉0.4%、氯化钠0.05%、硫酸镁0.06%、磷酸氢二钾0.2%、碳酸钙0.1%、水余量，121℃灭菌，ph7.0-7.2。
对比例4
按照实施例1的扦插育苗方法栽培忍冬植株，采集花蕾，不同的是：基质、插床和忍冬扦插枝条均不采用真菌菌液进行处理。
为了验证本发明栽培方法对花蕾次生代谢产物含量的影响，在山东平邑进行栽培实验。实验方法是：选择合适的移栽地，将其分为多块小区，每小区面积66.7m2，采用随机区组排列，每块小区分别按照实施例1-5和对比例1-4中的一种方法栽培忍冬，每种栽培方法重复4次。除了真菌菌液的处理不同外，保持其他的育苗管理一致，例如施肥、施药、浇水、除草。
实验过程中，记录忍冬植株的生长状况、采集花蕾后对花蕾中的绿原酸进行检测，评价各种方法对绿原酸含量的影响。
绿原酸含量检测方法如下：
1、对照品溶液的制备：取绿原酸对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加50％甲醇制成每1ml含40μg的溶液，即得(10℃以下保存)。
样品溶液的制备：花蕾样品采后置于40-50℃低温烘干后研磨，取所需测定样品的细粉末(过4号筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇50ml，超声处理1h，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取滤液10ml，用有机膜（孔径0.2μm）过滤至液相小瓶中，待用。
2、含量检测：采用液相色谱法进行检测，色谱柱为c18（4.60mm×250mm，1.7µm），流动相为乙腈-0.4wt％磷酸溶液(体积比13：87)，检测波长为327nm，进样量为20ul，柱温为40℃。理论板数按绿原酸峰计算应不低于1000。
具体的检测方法为：将对照品溶液配成不同的浓度，通过液相色谱检测得到以浓度和峰面积为横纵坐标的标准曲线。将各样品溶液采用同样的方法进行液相色谱检测，根据峰面积计算各样品中绿原酸含量。
实验过程发现，采用实施例1-5和对比例2、3的方法进行忍冬栽培时，忍冬植株生长速度较对比例1和4快，植株现蕾也早于对比例1和4，植株高度平均高约1.5cm左右。并且实施例1-5和对比例2和3的忍冬植株病虫害发病率少。对采集的花蕾进行绿原酸检测，结果如下表1所示，从表中可以看出，实施例1-5的方法得到的花蕾中绿原酸含量明显高于各对比例的方法，而单用茶藨子叶状层菌菌液或木霉菌菌液、或者采用其他菌与茶藨子叶状层菌菌液配合使用的效果均不明显，本发明真菌菌液对忍冬花蕾次生代谢产物的积累有很好的促进作用。