一种金钱松种子播前处理方法与流程

本发明涉及园林植物科学技术领域，具体地说是一种金钱松种子播前处理方法。

背景技术：

金钱松属松科落叶松亚科金钱松属，单属单种，为中国特有的孑遗植物，最早的化石发现于地质年代的的晚白垩世地层中，古新世至上新世在斯匹次卑尔根群岛、欧洲、美洲、亚洲亦有发现。根据化石资料推测，金钱松可能起源于白垩纪中晚期，曾广泛分布于北纬33°～52°之间；中更新世以前曾分布于我国华北地区；更新世大冰期后，各地金钱松相继灭绝，只有在我国长江中下游地区幸存下来，成为现今中国特有的单属单种植物。根据世界自然保护联盟（IUCN）新制定的物种受威胁的分类系统标准和中国植物红皮书的标准，金钱松均被定为渐危种，并被列为国家二级保护植物。

金钱松树干通直，树冠卵状塔形，雄壮美观。短枝上叶簇生呈圆盘状，叶色初始嫩绿，入秋转为金黄，故名金钱松，是优良的建筑、家具等用材树种和园林绿化树种，历史上就作为珍贵的用材树种和观赏树种而栽培。金钱松具有较高的观赏价值，其树形优美，叶片条形，扁平柔软，春夏为浅绿色，柔翠娇嫩，秋后变金黄色，圆如铜钱，如簇簇黄金，是优良的观赏树种。早在19世纪就被引种美国，目前已在世界各地广泛栽培，与南洋杉、雪松、日本金松、北美巨杉合称为世界五大庭园树木。金钱松是珍贵的经济树木，其树干通直，材性优良，可作建筑、家具及木纤维工业原料等用；叶片可提取植物挥发油，应用于制药、香料、香精、化妆品及食品等工业；根皮是传统的中药材，俗称土槿皮，能杀虫止痒，抗真菌，外用治疗手脚癣、神经性皮炎、湿疹等。研究发现，土槿皮的化学成分主要有二萜类、三萜类、三萜内酯及甾醇类以及其他类化合物。现代药理学实验表明，金钱松的天然提取物具有抗真菌、抗肿瘤、抗生育、抑制血管生成等功效。

目前虽然有研究进行金钱松的扦插、嫁接、组培等繁殖方式，但仅停留在研究阶段，技术不够成熟，没有应用价值。种子繁殖是自然状态下金钱松的主要繁殖方式，金钱松种子育苗是生产的必须环节。但由于金钱松结实有大小年之分，3～5年才能丰产一次，而且种子富含油脂，种壳极薄，因此新种出芽率不高，一般新种出芽率都在40%以下，并且经隔两三年储藏后因各种因素造成种子陈化。金钱松陈种生活力下降、出苗率更加降低，给金钱松的育苗生产带来较大的经济损失。因此，如何提高金钱松种子的活力，对种质资源的保护和利用、金钱松生产及经济效益的提高具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有金钱松种子生命活力差、出芽率低的缺陷，提供了一种通过药剂处理、N⁺离子束注入和超声波处理的协同效应，从而大大提高了金钱松新种和陈种生活力和出苗率的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案解决的：

一种金钱松种子播前处理方法，其特征在于：所述金钱松种子播前处理方法的步骤为：

（1）金钱松种子杀菌消毒：将待处理的金钱松种子清洗后放入培养皿中，在培养皿中加入0.6%次氯酸钠溶液，灭菌15～20min，灭菌后用超纯水冲洗3～5次；

（2）金钱松种子活性剂浸泡处理：将金钱松种子先在低浓度活性剂中浸泡2～4h，然后将种子取出，晾干，用喷壶喷施高浓度的活性剂并翻动金钱松种子使种子均匀浸湿，再次晾干，反复2～3次后将种子烘干；

（3）N⁺离子束注入金钱松种子：将金钱松种子胚部朝向离子束注入方向放入样品盘，离子注入前开机预热2h，在真空下以能量为25KeV、束流大小10mA、每次脉冲时间为5s、靶室真空度为6.0×10^-4～1.3×10^-3Pa进行N⁺离子束注入；

（4）金钱松种子低温干燥保存，超声波处理后育苗：将离子束注入后的金钱松种子低温干燥保存，育苗前用20%聚乙二醇溶液浸种24h，然后用55～65kHz超声波处理15min，然后取出，浸种催芽2～3d后播种育苗。

所述步骤（2）中低浓度活性剂组分及配比为：ZnSO₄ 20～25g/L，CuSO₄·5H₂O 10～12g/L，MnCl₂ 6～8g/L；所述高浓度活性剂内组分浓度为低浓度活性剂的12～15倍。

所述步骤（3）中N⁺离子束注入剂量为6～8×10³⁶ion/cm²。

所述步骤（4）中低温干燥保存指的是温度低于5℃，湿度低于45%。

本发明相比现有技术有如下优点：

目前虽然有N⁺离子束注入和超声波处理植物种子会提高出芽率的研究报道，但是N⁺离子束注入和超声波处理对种子萌发的促进效果非常有限，实用价值较低。本发明创造性的采用活性剂处理后再施加离子束注入和超声波处理的方法，药剂处理、N⁺离子束注入和超声波处理后出现显著的协同效应，从而大大提高了金钱松种子的生活力和出苗率，对金钱松种质资源的保护和利用、金钱松生产及经济效益的提高均具有重要意义。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

一种金钱松种子播前处理方法，其特征在于：所述金钱松种子播前处理方法的步骤为：

（1）金钱松种子杀菌消毒：将待处理的金钱松种子清洗后放入培养皿中，在培养皿中加入0.6%次氯酸钠溶液，灭菌15～20min，灭菌后用超纯水冲洗3～5次；

（2）金钱松种子活性剂浸泡处理：将金钱松种子先在低浓度活性剂（低浓度活性剂组分及配比为：ZnSO₄ 20～25g/L，CuSO₄·5H₂O 10～12g/L，MnCl₂ 6～8g/L）中浸泡2～4h，然后将种子取出，晾干，用喷壶喷施高浓度的活性剂（高浓度活性剂内组分浓度为低浓度活性剂的12～15倍）并翻动金钱松种子使种子均匀浸湿，再次晾干，反复2～3次后将种子烘干；

（3）N⁺离子束注入金钱松种子：将金钱松种子胚部朝向离子束注入方向放入样品盘，离子注入前开机预热2h，在真空下以能量为25KeV、束流大小10mA、每次脉冲时间为5s、靶室真空度为6.0×10^-4～1.3×10^-3Pa进行N⁺离子束注入，N⁺离子束注入剂量为6～8×10³⁶ion/cm²；

（4）金钱松种子低温干燥保存，超声波处理后育苗：将离子束注入后的金钱松种子置于温度低于5℃、湿度低于45%的低温干燥环境下保存，育苗前用20%聚乙二醇溶液浸种24h，然后用55～65kHz超声波处理15min，然后取出，浸种催芽2～3d后播种育苗。

实施例

一、不同处理方法对金钱松种子育苗成活率的影响

2013年从市场上采购新收获的金钱松种子，当年进行发芽率检测，得到新种发芽率为35.8%，然后置于温度低于5℃、湿度低于45%的低温干燥环境下保存，2015年3月新购买金钱松种子，并取出陈种进行发芽试验，金钱松陈种的平均发芽率为12.1%，可以发现金钱松陈种的出芽率更加低下。

当年3月分别取金钱松新种和陈种，分别分成8组，新种组和陈种组每组160粒，育苗前分别采用进行不同处理方法，然后检测种子发芽率变化。不同分组对应的处理方法如下：

第1组新种组和陈种组均采用本发明的综合处理方法，具体为：（1）金钱松种子杀菌消毒：将待处理的金钱松种子清洗后放入培养皿中，在培养皿中加入0.6%次氯酸钠溶液，灭菌17.5min，灭菌后用超纯水冲洗4次；（2）金钱松种子活性剂浸泡处理：将金钱松种子先在低浓度活性剂（低浓度活性剂组分及配比为：ZnSO₄ 22.5g/L，CuSO₄·5H₂O 11g/L，MnCl₂ 7g/L）中浸泡3h，然后将种子取出，晾干，用喷壶喷施高浓度的活性剂（高浓度活性剂内组分浓度为低浓度活性剂的12倍）并翻动金钱松种子使种子均匀浸湿，再次晾干，反复2次后将种子烘干；（3）N⁺离子束注入金钱松种子：将金钱松种子胚部朝向离子束注入方向放入样品盘，离子注入前开机预热2h，在真空下以能量为25KeV、束流大小10mA、每次脉冲时间为5s、靶室真空度为8.5～9.5×10^-4Pa进行N⁺离子束注入，N⁺离子束注入剂量为7×10³⁶ion/cm²；（4）金钱松种子低温干燥保存，超声波处理后育苗：将离子束注入后的金钱松种子置于温度0度的低温冷藏柜中干燥保存，育苗前用20%聚乙二醇溶液浸种24h，然后用60kHz超声波处理15min，然后取出，浸种催芽3d后播种育苗，测发芽率；

第2组新种组和陈种组均仅采用药剂处理，具体为：（1）金钱松种子杀菌消毒：将待处理的金钱松种子清洗后放入培养皿中，在培养皿中加入0.6%次氯酸钠溶液，灭菌17.5min，灭菌后用超纯水冲洗4次；（2）金钱松种子活性剂浸泡处理：将金钱松种子先在低浓度活性剂（低浓度活性剂组分及配比为：ZnSO₄ 22.5g/L，CuSO₄·5H₂O 11g/L，MnCl₂ 7g/L）中浸泡3h，然后将种子取出，晾干，用喷壶喷施高浓度的活性剂（高浓度活性剂内组分浓度为低浓度活性剂的12倍）并翻动金钱松种子使种子均匀浸湿，再次晾干，反复2次后将种子烘干后播种育苗，测发芽率；

第3组新种组和陈种组均仅采用N⁺离子束注入处理，具体为：（1）金钱松种子杀菌消毒：将待处理的金钱松种子清洗后放入培养皿中，在培养皿中加入0.6%次氯酸钠溶液，灭菌17.5min，灭菌后用超纯水冲洗4次；（2）N⁺离子束注入金钱松种子：将金钱松种子烘干后胚部朝向离子束注入方向放入样品盘，离子注入前开机预热2h，在真空下以能量为25KeV、束流大小10mA、每次脉冲时间为5s、靶室真空度为8.5～9.5×10^-4Pa进行N⁺离子束注入，N⁺离子束注入剂量为7×10³⁶ion/cm²，然后育苗，测发芽率；

第4组新种组和陈种组均仅采用超声波处理，具体为：（1）金钱松种子杀菌消毒：将待处理的金钱松种子清洗后放入培养皿中，在培养皿中加入0.6%次氯酸钠溶液，灭菌17.5min，灭菌后用超纯水冲洗4次；（2）金钱松种子低温干燥保存，超声波处理后育苗：将烘干处理后的金钱松种子置于温度0度的低温冷藏柜中干燥保存，育苗前用20%聚乙二醇溶液浸种24h，然后用60kHz超声波处理15min，然后取出，浸种催芽3d后播种育苗，测发芽率；

第5组新种组和陈种组均仅采用药剂处理和N⁺离子束注入处理，具体为：（1）金钱松种子杀菌消毒：将待处理的金钱松种子清洗后放入培养皿中，在培养皿中加入0.6%次氯酸钠溶液，灭菌17.5min，灭菌后用超纯水冲洗4次；（2）金钱松种子活性剂浸泡处理：将金钱松种子先在低浓度活性剂（低浓度活性剂组分及配比为：ZnSO₄ 22.5g/L，CuSO₄·5H₂O 11g/L，MnCl₂ 7g/L）中浸泡3h，然后将种子取出，晾干，用喷壶喷施高浓度的活性剂（高浓度活性剂内组分浓度为低浓度活性剂的12倍）并翻动金钱松种子使种子均匀浸湿，再次晾干，反复2次后将种子烘干；（3）N⁺离子束注入金钱松种子：将金钱松种子胚部朝向离子束注入方向放入样品盘，离子注入前开机预热2h，在真空下以能量为25KeV、束流大小10mA、每次脉冲时间为5s、靶室真空度为8.5～9.5×10^-4Pa进行N⁺离子束注入，N⁺离子束注入剂量为7×10³⁶ion/cm²；浸种催芽3d后播种育苗，测发芽率；

第6组新种组和陈种组均仅采用药剂处理和超声波处理，具体为：（1）金钱松种子杀菌消毒：将待处理的金钱松种子清洗后放入培养皿中，在培养皿中加入0.6%次氯酸钠溶液，灭菌17.5min，灭菌后用超纯水冲洗4次；（2）金钱松种子活性剂浸泡处理：将金钱松种子先在低浓度活性剂（低浓度活性剂组分及配比为：ZnSO₄ 22.5g/L，CuSO₄·5H₂O 11g/L，MnCl₂7g/L）中浸泡3h，然后将种子取出，晾干，用喷壶喷施高浓度的活性剂（高浓度活性剂内组分浓度为低浓度活性剂的12倍）并翻动金钱松种子使种子均匀浸湿，再次晾干，反复2次后将种子烘干；（3）金钱松种子低温干燥保存，超声波处理后育苗：将金钱松种子置于温度0度的低温冷藏柜中干燥保存，育苗前用20%聚乙二醇溶液浸种24h，然后用60kHz超声波处理15min，然后取出，浸种催芽3d后播种育苗，测发芽率；

第7组新种组和陈种组均仅采用N⁺离子束注入处理和超声波处理，具体为：（1）金钱松种子杀菌消毒：将待处理的金钱松种子清洗后放入培养皿中，在培养皿中加入0.6%次氯酸钠溶液，灭菌17.5min，灭菌后用超纯水冲洗4次；（2）N⁺离子束注入金钱松种子：将金钱松种子烘干后胚部朝向离子束注入方向放入样品盘，离子注入前开机预热2h，在真空下以能量为25KeV、束流大小10mA、每次脉冲时间为5s、靶室真空度为8.5～9.5×10^-4Pa进行N⁺离子束注入，N⁺离子束注入剂量为7×10³⁶ion/cm²；（3）金钱松种子低温干燥保存，超声波处理后育苗：将离子束注入后的金钱松种子置于温度0度的低温冷藏柜中干燥保存，育苗前用20%聚乙二醇溶液浸种24h，然后用60kHz超声波处理15min，然后取出，浸种催芽3d后播种育苗，测发芽率；

第8组新种组和陈种组均不做任何处理，用于空白对照，测金钱松新种和陈种的发芽率。不同处理方式下金钱松种子的发芽率检测结果如下表1所示。

由表1不同处理方式对金钱松新种和陈种发芽率影响的试验结果可以发现，药剂处理、N⁺离子束注入和超声波处理均会对金钱松新种和陈种发芽率都产生正向效应，然而单一处理（第2、3、4组）对发芽率的影响比较小（新种发芽率分别增益2%、4.3%、2.2%；陈种发芽率分别增益0.8%、5.7%、2.8%；）。三种方式同时处理金钱松陈种（第1组），金钱松陈种的发芽率得到了显著的提升，新种和陈种发芽率分别达到了49.8%和29.7%，发芽率分别增加了14.9%和17.6%，而三种处理单独施加的增益效应之和分别为8.5%和9.3%，说明三种处理方式的共同施加产生了协同效果。

分析表1还可以发现，去除药剂处理或N⁺离子束注入的双因素试验（第6、7组），结果金钱松发芽率均显著降低，发芽率与单因素处理的发芽率比较接近，而去除超声波处理的处理方式（第5组），金钱松陈种的发芽率虽然降低，但接近三因素共同施加的效果，说明协同作用主要是药剂处理和N⁺离子束注入互作产生的。

二、药剂处理和N⁺离子束注入互作提高金钱松发芽率的机理分析

离子束注入产生生物效应与辐射等不同，离子束发挥作用是三位一体的，包括能量沉积、质量沉积和电荷交换。通常状况，离子束注入会对植物种子的萌发具有抑制效应，但是在低剂量状况下，离子束注入会提高种子的发芽率，这是由于低能离子束注入会给种子细胞壁细胞膜上造成孔洞，从而提高了种子的通透性的结果。金钱松的新种子收获后，需要打破休眠才能萌发，因此，新种发芽率提高的一个原因很可能是离子束注入提高了种子通透性，从而打破了种子休眠的结果。

离子束对生物体的溅射作用会破坏细胞壁和细胞膜结构，为外源物质进入细胞提供良好的微通道；伴随着离子注入的质量沉积会降低细胞表面的负电性，减弱了受体对外源物质的静电排斥作用；低能离子束对生物体的直接作用和间接作用使得药剂溅射入细胞中，沉积在种子细胞表面的药剂受到离子束的攻击，从而溅射入细胞。药剂处理与离子束注入互作增效机理又有不同，我们研究中发现，采用其它的药剂或其它配比会降低药剂效应，选择其它金属离子甚至会产生抑制效应，说明药剂中的元素在金钱松种子中里产生了化学作用。

在金钱松陈种育苗中，我们发现只有ZnSO₄ 、CuSO₄和MnCl₂的组合与离子束注入才有协同效应，其中，锌与碳水化合物的转化有关，也能促进蛋白质的合成，铜对氨基酸活化及蛋白质合成有促进作用，而锰能促进氨基酸合成肽，有利于蛋白质合成，也能促进肽水解生成氨基酸，并运往新生的组织和器官，而至于ZnSO₄ 、CuSO₄和MnCl₂溅射入种子后如何发挥作用的，其具体作用机理还有待进一步研究。

本发明通过药剂处理、N⁺离子束注入和超声波处理的协同效应，对金钱松新种和陈种都大大提高了出苗率，本发明对金钱松种质资源的保护和利用、金钱松生产及经济效益的提高均具有重要意义。

以上实施例仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明保护范围之内；本发明未涉及的技术均可通过现有技术加以实现。