本发明涉及农业生物技术中植物组织培养的方法，具体地说，涉及一种岭南药食同源植物三叉苦的快速繁殖方法。
背景技术：
三叉苦(melicopepteleifolia(championexbentham)hartley)，又名三桠苦、三丫苦、三叉虎、斑鸠花、三支枪、三脚鳖等，为芸香科蜜茱萸属药用植物，最早记载于《岭南采药录》，是岭南地区常用的中草药，常用来治疗跌打损伤、脓疮、湿疹等疾病。三叉苦具有清热解毒、祛风除湿、消肿止痛等功效，常用于咽喉肿痛、疟疾、黄疸型肝炎、风湿骨痛、湿疹、皮炎、疮疡等疾病的治疗，目前己被广泛应用于中成药品中，如三九感冒灵颗粒、三九胃泰、三金片等。同时，三叉苦又是一种常用的药食同源植物，具有较高的食用价值，作为广东凉茶的重要原料约有100余年的历史。三叉苦作为一种应用比较广泛的民族药，具有一定的临床应用基础，有着广泛的应用前景和开发利用价值。
三叉苦在我国主要分布于广东、广西、海南、福建、台湾、贵州和云南等省区，四川和重庆等地区有少量分布，常见于丘陵、平原、溪边和林缘的灌木丛。目前，三叉苦基本上处于野生状态，野生三叉苦质量较好，价格不断上扬，致其野生资源被过度采割，为了防止三叉苦资源的匮乏和满足未来对其开发利用的需要，人工大面积栽培势在必行。三叉苦主要采用种子和扦插繁殖，但由于三叉苦种子硬实，发芽率低，而扦插繁殖存在周期长、繁殖系数低等缺点，建立三叉苦的组培快繁技术已成为大面积规模化种植首要解决的技术。因此，本发明选择野生三叉苦新生营养芽为外植体，经诱导、增殖、生根以及移栽等步骤，实现了三叉苦的快速繁殖。本发明具工艺简便、易操作、繁殖系数高、成苗快等特点，可直接用于三叉苦的产业化繁育，对于三叉苦的遗传改良、种质资源保护、促进资源的可待续利用具有重要意义。
目前，国内外尚未有三叉苦组织培养技术的报道，也未有三叉苦组培快繁专利的申请。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种岭南药食同源植物三叉苦的快速繁殖方法，本发明选择野生三叉苦新生营养芽为外植体，经诱导、增殖、生根以及移栽等步骤，实现了三叉苦的快速繁殖，从而实现了本发明的目的。
本发明提供的技术方案为：一种岭南药食同源植物三叉苦的快速繁殖方法，其特征在于：包括依次进行的如下步骤：获取三叉苦植株的外植体、不定芽诱导、不定芽的增殖培养、不定芽的生根培养、试管苗移栽；
所述的不定芽诱导的不定芽诱导培养基包括：nitsch培养基、1.0～3.0mg/l6-ba、0.5～1.0mg/lnaa、0.01～0.05mg/ltdz、25～30g/l蔗糖、3.5～6.0g/l琼脂、0.1～0.3g/l活性炭，ph为5.4～5.8。
在上述的岭南药食同源植物三叉苦的快速繁殖方法中，所述的不定芽诱导的方法为：将三叉苦的外植体清洗消毒后剪切成1.0～1.5cm左右的带节茎段并接种到不定芽诱导培养基中在25～28℃进行全暗培养45～60天即可诱导形成不定芽。
在上述的岭南药食同源植物三叉苦的快速繁殖方法中，不定芽的增殖培养所用的不定芽增殖培养基包括：nitsch培养基、1.0～1.5mg/l6-ba、0.5～1.0mg/lnaa、15～30g/l蔗糖、3.5～6.0g/l琼脂、0.2～0.5g/l活性炭，ph为5.4～5.8。
在上述的岭南药食同源植物三叉苦的快速繁殖方法中，所述的不定芽的增殖培养的方法为：将经过不定芽诱导得到的不定芽切成长约1～2cm的茎段并接种到不定芽增殖培养基中培养35～40天即可实现不定芽的增殖培养。
在上述的岭南药食同源植物三叉苦的快速繁殖方法中，不定芽的生根培养所用的生根培养基包括：nitsch培养基、0.5～1.0mg/liba、1.0～2.0mg/lnaa、15～30g/l蔗糖、3.5～6.0g/l琼脂、0.1～0.2g/l活性炭，ph为5.4～5.8。
在上述的岭南药食同源植物三叉苦的快速繁殖方法中，所述的不定芽的生根培养的方法为：将切取经过增殖培养得到的长约2～3cm的不定芽并接种到生根培养基中培养25～30天即能实现试管苗的生根。
在上述的岭南药食同源植物三叉苦的快速繁殖方法中，所述的试管苗移栽的方法为：将健壮的试管苗在温室的自然光下炼苗1～3天，洗净根部的培养基移栽于体积比为1:1:1:1的泥炭土、腐殖土、红泥土、河沙的混合基质中栽培成苗即得种苗。
在上述的岭南药食同源植物三叉苦的快速繁殖方法中，所述的不定芽诱导、不定芽的增殖培养的培养条件均为：培养温度为25～28℃，光照强度为2000～3000lx，光照时间为10～12小时/天。
在上述的岭南药食同源植物三叉苦的快速繁殖方法中，获取三叉苦植株的外植体的具体方法为：秋季时节，在野外选取生长健壮的三叉苦植株，于根部离地面约5～10cm处进行环割以便来年春季生成新生营养芽；
春季，当三叉苦植株环割处营养芽生成时，用无菌解剖刀从基部切取营养芽并进行简单保湿保水处理。
有益效果：
本发明利用植物组织培养技术实现了岭南药食同源植物三叉苦的快速繁殖，本发明具工艺简便、易操作、繁殖系数高、成苗快等特点，可直接用于三叉苦的产业化繁育，通过本发明育成的三叉苦试管苗移栽成活率达到95％以上，可解决三叉苦的大面积规模化种植中存在种苗缺乏的问题。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，对本发明的技术方案作进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
实施例一
(1)外植体准备：2014年秋季时节，在野外选取生长健壮的三叉苦植株，于根部离地面约5cm处进行环割处理，2015年春季环割处生成了6～9个新生营养芽。
(2)外植体采集：春季，当步骤(1)处理的三叉苦植株环割处营养芽生成时，用无菌解剖刀从基部切取营养芽并进行简单保湿保水处理后及时带回实验室。
(3)不定芽诱导：将采取回实验室的外植体先在自来水冲洗过夜后于超净工作台中于75％的乙醇溶液中消毒15秒，无菌水冲洗2次后用无菌滤纸吸干水分后，再置于0.1％的升汞溶液中消毒10分钟，无菌水冲洗3次后用无菌滤纸吸干水分后剪切成1.0～1.5cm左右的带节茎段并接种到不定芽诱导培养基中在25℃进行全暗培养45天即可诱导形成不定芽，诱导率为87.3％，污染率低于15％。所述的不定芽诱导培养基为：nitsch培养基+3.0mg/l6-ba+1.0mg/lnaa+0.05mg/ltdz(n-苯基-n’-1,2,3-噻二唑-5-脲)+25g/l蔗糖+3.5g/l琼脂+0.1g/l活性炭，ph为5.4。
(4)增殖培养：将步骤(3)所得的不定芽切成长约1～2cm的茎段并接种到不定芽增殖培养基中培养35天即可实现不定芽的增殖培养，增殖系数达10倍。所述的不定芽增殖培养基为：nitsch培养基+1.5mg/l6-ba+1.0mg/lnaa+15g/l蔗糖+3.5g/l琼脂+0.2g/l活性炭，ph为5.4。
(5)生根培养：切取步骤(4)增殖得到的长约2～3cm的不定芽并接种到生根培养基中培养25天即能实现试管苗的生根，生根率达到94.8％。所述的生根培养基为：nitsch培养基+1.0mg/liba+2.0mg/lnaa+15g/l蔗糖+3.5g/l琼脂+0.1g/l活性炭，ph为5.4。
(6)移栽：将步骤(5)得到的健壮的试管苗在温室的自然光下炼苗1天，洗净根部的培养基移栽于体积比为1:1:1:1的泥炭土、腐殖土、红泥土、河沙的混合基质中栽培成苗即得种苗，移栽30天后成活率达到98.1％。
上述步骤(3)～(4)的培养条件为：培养温度为25℃，光照强度为2000lx，光照时间为10小时/天。
实施例二
(1)外植体准备：2015年秋季时节，在野外选取生长健壮的三叉苦植株，于根部离地面约8cm处进行环割处理，2016年春季在环割处理处生成了6～7个新生营养芽。
(2)外植体采集：2016年春季，当步骤(1)处理的三叉苦植株环割处营养芽生成时，用无菌解剖刀从基部切取营养芽并进行简单保湿保水处理后及时带回实验室。
(3)不定芽诱导：将采取回实验室的外植体先在自来水冲洗过夜后于超净工作台中于75％的乙醇溶液中消毒23秒，无菌水冲洗3次后用无菌滤纸吸干水分后，再置于0.1％的升汞溶液中消毒13分钟，无菌水冲洗4次后用无菌滤纸吸干水分后剪切成1.0～1.5cm左右的带节茎段并接种到不定芽诱导培养基中在26℃进行全暗培养52天即可诱导形成不定芽，诱导率达到90.5％，污染率低于10％。所述的不定芽诱导培养基为：nitsch培养基+2.0mg/l6-ba+0.8mg/lnaa+0.03mg/ltdz(n-苯基-n’-1,2,3-噻二唑-5-脲)+27g/l蔗糖+4.0g/l琼脂+0.2g/l活性炭，ph为5.6。
(4)增殖培养：将步骤(3)所得的不定芽切成长约1～2cm的茎段并接种到不定芽增殖培养基中培养37天即可实现不定芽的增殖培养，增殖系数达到7.9倍。所述的不定芽增殖培养基为：nitsch培养基+1.3mg/l6-ba+0.7mg/lnaa+23g/l蔗糖+4.0g/l琼脂+0.3g/l活性炭，ph为5.6。
(5)生根培养：切取步骤(4)增殖得到的长约2～3cm的不定芽并接种到生根培养基中培养28天即能实现试管苗的生根，生根率达到93.8％。所述的生根培养基为：nitsch培养基+0.7mg/liba+1.5mg/lnaa+23g/l蔗糖+4.0g/l琼脂+0.15g/l活性炭，ph为5.6。
(6)移栽：将步骤(5)得到的健壮的试管苗在温室的自然光下炼苗2天，洗净根部的培养基移栽于体积比为1:1:1:1的泥炭土、腐殖土、红泥土、河沙的混合基质中栽培成苗即得种苗,移栽30天后成活率达到97.8％。
上述步骤(3)～(4)的培养条件为：培养温度为26℃，光照强度为2500lx，光照时间为11小时/天。
实施例三
(1)外植体准备：2015年秋季时节，在野外选取生长健壮的三叉苦植株，于根部离地面约10cm处进行环割，2016年春季在环割处理处生成了5～6个新生营养芽。
(2)外植体采集：2016年春季，当步骤(1)处理的三叉苦植株环割处营养芽生成时，用无菌解剖刀从基部切取营养芽并进行简单保湿保水处理后及时带回实验室。
(3)不定芽诱导：将采取回实验室的外植体先在自来水冲洗过夜后于超净工作台中于75％的乙醇溶液中消毒30秒，无菌水冲洗3次后用无菌滤纸吸干水分后，再置于0.1％的升汞溶液中消毒15分钟，无菌水冲洗5次后用无菌滤纸吸干水分后剪切成1.0～1.5cm左右的带节茎段并接种到不定芽诱导培养基中在28℃进行全暗培养60天即可诱导形成不定芽，诱导率为83.6％，污染率低5％。所述的不定芽诱导培养基为：nitsch培养基+1.0mg/l6-ba+0.5mg/lnaa+0.01mg/ltdz(n-苯基-n’-1,2,3-噻二唑-5-脲)+30g/l蔗糖+6.0g/l琼脂+0.3g/l活性炭，ph为5.8。
(4)增殖培养：将步骤(3)所得的不定芽切成长约1～2cm的茎段并接种到不定芽增殖培养基中培养40天即可实现不定芽的增殖培养，增殖系数达到8.2倍。所述的不定芽增殖培养基为：nitsch培养基+1.0mg/l6-ba+0.5mg/lnaa+30g/l蔗糖+6.0g/l琼脂+0.5g/l活性炭，ph为5.8。
(5)生根培养：切取步骤(4)增殖得到的长约2～3cm的不定芽并接种到生根培养基中培养30天即能实现试管苗的生根,生根率为90.5％。所述的生根培养基为：nitsch培养基+0.5mg/liba+1.0mg/lnaa+30g/l蔗糖+6.0g/l琼脂+0.2g/l活性炭，ph为5.8。
(6)移栽：将步骤(5)得到的健壮的试管苗在温室的自然光下炼苗3天，洗净根部的培养基移栽于体积比为1:1:1:1的泥炭土、腐殖土、红泥土、河沙的混合基质中栽培成苗即得种苗，移栽30天成活率为95.7％。
上述步骤(3)～(4)的培养条件为：培养温度为28℃，光照强度为3000lx，光照时间为12小时/天。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。