云芝糖肽用于抗病毒的新用途的制作方法

本发明涉及农药技术领域，特别是抗植物病毒农药领域，更进一步地涉及云芝糖肽作用于抗病毒的新用途。

背景技术：

植物病毒病是一类重要的植物病害，全球每年因植物病毒病危害而造成的经济损失多达600亿美元，其中仅粮食作物一项的损失就高达200亿美元。植物病毒没有完整的细胞结构，它对植物是绝对寄生的，再加上植物本身缺乏完整的免疫系统，植物一旦被病毒侵染后，便终生带毒，持续遭受危害，这给植物病毒病的防治带来了极大的困难。目前，农业生产上还没有特效的抗植物病毒药剂。面对植物病毒病危害严重，抗植物病毒药剂短缺的局面，开发新型的抗植物病毒活性成分并研究其抗病毒机理具有重要的意义。近年来，高活性、低毒性、环境相容性好、副作用小的生物源多糖、糖肽、蛋白质等活性成分的研究受到了众多科研工作者的青睐。更有大量研究表明，许多生物源多糖、糖肽以及寡糖等对植物防御病原菌的入侵具有较好的免疫调控作用。这些发现为抗植物病毒药剂的开发提供了新的思路。

本实验室前期开展了生物源抗植物病毒活性材料的筛选、活性成分的分离鉴定及其抗病毒机理研究，由微生物源材料中得到云芝糖肽对烟草花叶病毒和大麦黄矮病毒等具有较高的抑制活性。该云芝糖肽是从多孔菌科真菌云芝(coriolusversicolor)cov-1菌株的菌丝体中提取分离的高分子糖肽聚合物。该糖肽分子结构稳定，可通过云芝菌的发酵提取来大量获得，其发酵获取成本低、提取工艺简单且不受外界环境条件的限制。更重要的是，该糖肽为微生物源天然产物，具有对人畜安全、对植物无副作用、无残留和不易产生抗药性的特点，是农业生产上急需的低毒性、高活性的抗病毒物质，具有极大的产业化应用的潜力。

关于云芝糖肽的生物活性，前人认为该糖肽具有抗肿瘤和抗肝炎的作用，在抗植物病毒的活性及其作用机理方面，在国内外一直未见相关的研究报道。本实验室发现了它具有较高的抗植物病毒活性并进一步研究其抗病毒机理，发现云芝糖肽处理可显著提高拟南芥许多tir-nbs-lrr受体蛋白基因、mapk蛋白激酶基因、wrky转录因子基因以及其它许多抗病相关基因的表达量，显著提高植物的抗病毒活性。

技术实现要素：

本发明提供了一种云芝糖肽用于抗病毒的新用途。

此外，由于本发明的云芝糖肽对多种植物病毒具有良好的抑制作用，本发明还提供一种云芝糖肽制备具有抗病毒作用的药物用途。

上述云芝糖肽用于防治烟草花叶病毒病(tobaccomosaicvirus，tmv)、小麦黄矮病毒病(barleyyellowdwarfvirus，bydv)或水稻条纹叶枯病毒病(ricestipevirus，rsv)，相比现有的抗病毒剂，例如以宁南霉素等为主要成分的抗病毒剂，具有更好的效果，其浓度为500μg/ml时，对烟草花叶病毒的防治效果至少为80％。

上述云芝糖肽可以采用现有技术公知的方法制成含有云芝糖肽的药物组合物，以及任何一种农药学上可接受的剂型，如水剂、可溶性液剂、乳油、微乳剂、悬浮剂、水乳剂、可湿性粉剂或水分散粒剂药物组合物等。

上述云芝糖肽可以直接作用于tmv病毒，使tmv病毒粒子聚集和断裂，还可以诱导烟草提高其pal和pod酶活性，从而提高植物的抗病能力。

上述云芝糖肽可增强植物的水杨酸、小分子物质合成以及蛋白激酶相关基因的富集，从而提高植物的抗病能力。

附图说明

图1：半叶法测定云芝糖肽对tmv的治疗效果，烟草叶片接种tmv病毒后，左侧叶片用云芝糖肽处理，右侧叶片用水处理作为对照。a：云芝糖肽浓度为100μgml^-1；b：云芝糖肽浓度为500μgml^-1；

图2：dot-elisa试验测定云芝糖肽对tmv病毒的抑制活性，斑点颜色深浅代表病毒含量高低，1：阳性对照，2：100μg·ml^-1云芝糖肽处理，3：200μg·ml^-1云芝糖肽处理，4：400μg·ml^-1云芝糖肽处理，5：800μg·ml^-1云芝糖肽处理，6：200μg·ml^-1宁南霉素处理；

图3：云芝糖肽处理的烟草pal和pod酶活性测定结果，a：pal，b：pod，ck：水处理；t1：tmv处理，t2：tmv处理后500μg·ml^-1云芝糖肽处理，所有结果都是平均数±标准差，重复3次；

图4：云芝糖肽对tmv病毒粒子形态影响结果图，tmv病毒粒子浓度为0.58mg·ml^-1。日丽透射电镜观察样品，a：正常tmv病毒粒子；b：tmv病毒粒子用100μg·ml^-1云芝糖肽处理60min；c：tmv病毒粒子用500μg·ml^-1云芝糖肽处理60min；

图5：云芝糖肽诱导拟南芥显著差异基因生物过程富集图，云芝糖肽处理显著增强拟南芥水杨酸、小分子物质合成以及蛋白激酶相关基因的富集。

具体实施方式

为了理解本发明，下面以实施例进一步说明本发明，但下述实施例并不限制本发明。

实施例1：云芝糖肽对tmv病毒的室内治疗效果。

(1)实验条件：作物选择室内盆栽烟草，品种为心叶烟；靶标为tmv。

(2)试验设计和安排：试验药剂为云芝糖肽，设立8％宁南霉素水剂对照药剂和清水对照。3个处理，重复3次。

(3)施药方法：心叶烟长至5-6叶期，用于试验。采用半叶枯斑法，整个叶片先接种tmv病毒，接种2小时后，叶片左半叶涂抹云芝糖肽或对照药剂，右半叶涂抹清水作为对照。

(4)调查方法：涂抹药剂后5天，统计左右半叶片产生的枯斑数量，按照如下公式计算防治效果：

防治效果(％)＝(右半叶枯斑数-左半叶枯斑数)/左半叶枯斑数×100

(5)实验结果：云芝糖肽对tmv的治疗效果见表1，由表1可见云芝糖肽在浓度为500μgml^-1时对tmv的室内治疗效果为85.4％。

表1云芝糖肽对烟草花叶病毒病的室内防治效果

实施例2：云芝糖肽对烟草花叶病毒病的大田防治效果。

(1)实验条件：作物选择大田烟草，品种为k326；靶标为tmv。

(2)试验设计和安排：试验药剂为云芝糖肽，设立8％宁南霉素水剂对照药剂和清水对照。3个处理，重复3次，共9个小区。试验小区按随机区组排列。

(3)施药方法：烟草移栽后20天进行喷雾施药，隔7天后第二次喷药。

(4)调查方法：第二次施药后14天后进行药效调查，根据以下标准记录发病情况：

0级：全株无病；1级：新叶表现轻微花叶；2级：三分之一至二分之一叶片表现花叶；3级：二分之一至三分之二叶片表现花叶；4级：全株叶片花叶。

病情指数＝∑(各级病株数×相对级数值)/(调查总株数×最高分级值)×100％

防治效果(％)＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100

(5)实验结果：云芝糖肽对烟草花叶病毒病的防治效果见表2，由表2可见云芝糖肽在浓度为500μgml^-1时对烟草花叶病毒病的防治效果为80.3％。

表2云芝糖肽对烟草花叶病毒病的大田防治效果

实施例3：云芝糖肽对小麦黄矮病毒病的大田防治效果。

(1)实验条件：作物选择大田小麦，品种为小偃6号；靶标为bydv。

(2)试验设计和安排：试验药剂为云芝糖肽，设立8％宁南霉素水剂对照药剂和清水对照。3个处理，重复3次，共9个小区。试验小区按随机区组排列。

(3)施药方法：小麦返青后20天进行喷雾施药，隔7天后第二次喷药。

(4)调查方法：第二次施药后14天后进行药效调查，每点调查相连的10株小麦，每小区调查250株，根据以下标准记录发病情况：

0级：全株无病；1级：部分叶尖黄化；2级：旗叶下1片叶黄化；3级：旗叶下2片叶黄化；4级：旗叶黄化1/4，旗叶下1片叶黄化；5级：旗叶黄化1/4，旗叶下2片叶黄化；6级：旗叶黄化；7级：旗叶黄化，旗叶下1片叶黄化；8级：旗叶黄化，旗叶下2片叶黄化；9级：植株矮化，但能抽穗；10级：植株矮化显著，不能抽穗。

病情指数＝∑(各级病株数×相对级数值)/(调查总株数×最高分级值)×100％

防治效果(％)＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100

(5)实验结果：云芝糖肽对小麦黄矮病毒病的防治效果见表3，由表3可见云芝糖肽在浓度为500μgml^-1时对小麦黄矮病毒病的防治效果为75.7％。

表3云芝糖肽对小麦黄矮病毒病的大田防治效果

实施例4：云芝糖肽对水稻条纹叶枯病毒病的大田防治效果。

(1)实验条件：作物选择大田水稻，品种为两优培九；靶标为rsv。

(2)试验设计和安排：试验药剂为云芝糖肽，设立8％宁南霉素水剂对照药剂和清水对照。3个处理，重复3次，共9个小区。试验小区按随机区组排列。

(3)施药方法：水稻移栽后20天进行喷雾施药，隔7天后第二次喷药。

(4)调查方法：第二次施药后14天后进行药效调查，每点调查相连的10株水稻，每小区调查250株，根据以下标准记录发病情况：

0级：全株无病；1级：心叶基部沿叶脉出现少量褪绿黄斑，不卷曲；3级：新生叶出现与叶脉平行的黄绿相间条纹，轻微卷曲；5级：新生叶出现大量与叶脉平行的黄绿相间条纹，叶片卷曲、细弱；7级：植株矮化，叶片出现黄白色条纹卷起，新生叶扭曲下垂，不能正常开张；9级：植株严重矮化、失绿或死亡。

病情指数＝∑(各级病株数×相对级数值)/(调查总株数×最高分级值)×100％

防治效果(％)＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100

(5)实验结果：云芝糖肽对水稻条纹叶枯病毒病的防治效果见表4，由表4可见云芝糖肽在浓度为500μgml^-1时对水稻条纹叶枯病毒病的防治效果为74.7％。

表4云芝糖肽对小麦黄矮病毒病的大田防治效果

实施例5：叶盘法测定云芝糖肽对tmv病毒的抑制效果。

k326烟草叶片接种tmv病毒48小时后，用1cm打孔器取烟草叶圆片，分别浸泡在100、200、400、800μg·ml^-1的云芝糖肽溶液、200μg·ml^-1的宁南霉素溶液和清水中。健康叶片浸泡在清水中作为阴性对照。叶圆片置于光照培养箱培养，48小时后，采用dot-elisa试验测定tmv病毒的含量。

结果，相对于宁南霉素处理和水处理，云芝糖肽处理组随着云芝糖肽浓度的升高，tmv病毒的含量在不断降低，表明云芝糖肽对tmv病毒具有较好的治疗效果。

实施例6：云芝糖肽诱导烟草提高pal和pod酶的活性。

用500μg·ml^-1云芝糖肽处理k326烟草，处理后于1至9天，每天采集烟草叶片测定烟草pal和pod酶的活性，分别以tmv和清水处理作为对照，试验设3次重复。

结果，相对于tmv处理和水处理，云芝糖肽处理组烟草pal和pod酶的活性均有显著提高，均在第7天达到峰值，表明云芝糖肽通过诱导提高烟草pal和pod酶的活性来提高其抗病毒能力。

实施例7：云芝糖肽诱导拟南芥提高抗病相关基因的表达量。

用500μg·ml^-1云芝糖肽处理拟南芥，24小时后采拟南芥植株，提取rna，测定拟南芥的转录组，分别以tmv和清水处理作为对照，试验设3个重复。分析拟南芥的转录组数据。

结果，云芝糖肽处理显著增强了拟南芥水杨酸、小分子物质合成以及蛋白激酶相关基因的富集，显著提高了拟南芥的抗病性。

本发明的云芝糖肽作为抗病毒剂的应用已经通过具体的实例进行了描述，本领域技术人员可借鉴本发明内容，适当改变原料、工艺条件等环节来实现相应的其它目的，其相关改变都没有脱离本发明的内容，所有类似的替换和改动对于本领域技术人员来说是显而易见的，都被视为包括在本发明的范围之内。