本发明涉及植物初代组织培养，具体涉及一种芫花茎段外植体初代组织培养方法。
背景技术：
芫花(Daphne genkwa Sieb.et Zucc.)为瑞香科瑞香属落叶灌木，其花朵锦簇、花色艳丽，具有较高的观赏价值，为我国优良野生花卉资源。同时也是我国重要的中药材和生物农药。
从20世纪60年代开始，尤其是90年代以后，芫花的生境遭到严重破坏，种群分布范围缩小，居群数量及个体数量急剧下降，其野生可利用资源逐渐减少。研究芫花的繁殖技术成为保护和利用该植物资源的迫切要求。
芫花一般采用播种方法进行繁殖，但种子繁殖其后代性状发生分离，无法保持母本植株的优良性状。芫花的扦插繁殖，生根成活率低，加之穗源少，繁殖效率低，不能实现快速大量繁殖。采用组织培养方法繁殖芫花，可保持母本优良性状，为优良单株的快速扩繁提供途径。
目前，关于芫花的研究主要集中在其化学组分及药理作用，以及生物农药的研究上，在繁殖、栽培技术的相关研究较少，其茎段外植体组织培养快繁技术在国内外尚未见报道。
技术实现要素：
发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一种芫花茎段外植体初代组织培养方法，该方法采用茎段外植体诱导丛生芽，可以简单、快捷的获得芫花组培苗，培养周期明显缩短，培养成功率明显提高，并且萌芽率高，玻璃化率低。
技术方案：为了实现上述发明目的，如本发明所述一种芫花茎段外植体初代组织培养方法，包括如下步骤：
(1)芫花外植体的选取：采集生长健壮，腋芽饱满，无病虫害的芫花当年生枝条，去除全部叶片，剪截成8～10cm带腋芽茎段作为外植体；
(2)芫花外植体的处理：将外植体用洗衣粉溶液浸泡洗涤15～20min，接着用流水冲洗8～12小时，在无菌环境下将外植体剪成4-5cm茎段进行消毒处理；消毒后用无菌水冲洗，将茎段剪成1.5～2.5cm的长度，接入芫花茎段外植体初代组织培养的培养基中；
(3)芫花外植体的培养：将步骤(2)接入初代培养基中的外植体置于培养室的培养架进行光照培养，直至诱导丛生芽萌发。
其中，步骤(2)所述洗衣粉溶液(洗衣粉为市售的普通洗衣粉)质量体积比为0.2-0.5％，浸泡时间为15～20min，接着用流水冲洗8～12h。通常洗衣粉溶液浸泡时间为20min，流水冲洗时间为12h。芫花茎干表面密被短绒毛，直接进行消毒处理杀菌效果不理想。洗衣粉溶液可有效去除粘黏在茸毛上的污物，改善消毒效果；流水冲洗可进一步洗净粘黏在植物体表或绒毛上的污物，改善消毒效果。
步骤(2)所述消毒为先采用体积百分比浓度为70～75％乙醇溶液进行消毒，再将茎段放入1g·L-1升汞加3-5滴吐温80的混合溶液浸泡消毒。
进一步地，所述乙醇进行消毒的时间为30-45s，升汞加吐温80混合溶液的浸泡消毒时间为10～14min。吐温80为表面活性剂，可以湿润外植体表面组织，促进杀菌剂充分接触外植体表面组织，达到较好的消毒效果。
芫花茎段外植体初代组织培养基，包括如下组分：MS+0.1mg·L-1NAA+1.0-1.5mg·L-1ZT，加入蔗糖25-30g/L、琼脂6.5-7g/L，调整酸碱度至pH＝5.7-5.8。
作为优选，所述初代组织培养基，包括如下组分MS+0.1mg·L-1NAA+1.5mg·L-1ZT，加入蔗糖30g/L、琼脂7g/L，调整酸碱度至pH＝5.8。
其中，步骤(3)所述光照培养的温度22～25℃，光照强度2000～3000lx，相对湿度70-75％，光周期14h昼/10h夜。
步骤(3)所述光照培养的时间25-30d。
本发明所用的培养基和试剂都由市售可得。
本发明所用外植体为芫花当年生枝条，去除叶片，剪截成带腋芽茎段其优势在于：1.茎段外植体个体较大，消毒、清洗、剪切等试验操作方便易行；2.茎段外植体对消毒试剂具有较强耐受能力，消毒致死率低，较其他方法更易获得无菌试管苗。3.使用茎段外植体诱导丛生芽与愈伤组织诱导丛生芽的方法相比，其诱导丛生芽的萌发仅需打破腋芽休眠，而无须经历脱分化与再分化过程，因而成功率较高，其培养周期也明显缩短。
如果采用芫花其他部位为外植体(例如腋芽)，脱分化诱导愈伤组织，然后再分化形成丛生芽的方法进行初代培养。其缺点在于芫花腋芽极小(直径在1mm以下)，其采集、剪切、夹取等操作不便；萌动的腋芽外植体组织幼嫩，对消毒剂耐受程度低，消毒致死率高。外植体采用脱分化形成愈伤组织，然后再分化形成丛生芽的过程成功率低，过程耗时长。脱分化形成愈伤组织过程通常需1-2个月或更长时间；愈伤组织再分化形成丛生芽过程通常还需1-2个月或更长时间。且植物体细胞具有全能性为理论特性，实际培养过程中体细胞能否表达其全能性为随机事件。
有益效果：由现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明芫花茎段外植体初代组织培养方法，采用茎段外植体诱导丛生芽，可以简单、快捷的获得芫花组培苗。本发明采用茎段外植体诱导丛生芽与愈伤组织诱导丛生芽方法相比，其诱导无须经历脱分化与再分化过程，其培养周期明显缩短，培养成功率明显提高。
本发明对芫花茎段外植体采用预处理洗衣粉溶液浸泡，流水冲洗。外植体消毒采用乙醇和升汞加吐温混合溶液进行消毒的方法，可以获得大量无菌试管苗，无菌外植体试管苗是进行初代培养的必须材料，并且污染率小、死亡率低，存活率高。
本发明使用的芫花茎段外植体初代组织培养基，使得芫花茎段外植体萌芽率达到83.3％以上，玻璃化率低于22.3％，萌芽均高达到1.67cm以上。
附图说明
图1为本发明实施例2芫花茎段外植体初代培养从接种到茎段腋芽萌发生长情况。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明做进一步说明。
植物材料：
芫花母本植株选自江苏省句容市，江苏农林职业技术学院林木种质资源圃。芫花茎段外植体采自芫花实生2年生苗。
试验地点：
江苏农林职业技术学院园艺工程中心植物组培室。
试验设备：
超净工作台(上海咏星SW-CJ-2A)、培养架与控制系统(上海咏星PYJ-5-2)、全光谱节能灯(上海咏星ZPT-28)、立式压力蒸汽灭菌器(上海农卉YXQ-LS-100SII)、空调(格力)、电子天平(梅特勒托利多AL104、PL602-L)、玻璃培养瓶。
实验药品：
NAA(1-萘乙酸1-Naphthylacetic acid，C12H10O2≧98.0％，国药)、6-BA(6-苄基氨基嘌呤6-Benzylaminopurine，C12H11N5≧98.0％，国药)、ZT(玉米素trans-Zeatin，C10H13N5O≧98.0％，国药)、蒸馏水、无水乙醇(ethyl alcohol absolute，C2H6O)、氯化汞(Mercury(II)chloride HgCl2)、吐温80、洗衣粉、琼脂(agar，(C12H18O9)n，上海贺瑟根化工科技)、蔗糖(D(+)-Sucrose，C12H22O11)、MS培养基(北京金博蓝河科技)
实施例1
初代组织培养基：MS+0.1mg·L-1NAA+1.0mg·L-1ZT，加入蔗糖30g/L、琼脂7g/L，调整酸碱度至pH＝5.8。
培养方法：
(1)芫花外植体的选取：采集生长健壮，腋芽饱满，无病虫害的芫花当年生枝条，去除全部叶片，剪截成10cm带腋芽茎段作为外植体；
(2)芫花外植体的处理：将外植体用质量体积比为0.5％洗衣粉水溶液浸泡20min，接着用流水冲洗12h，在接种室的超净工作台无菌环境下再将外植体剪成4cm茎段，采用体积比75％乙醇水溶液消毒30s，再用1g·L-1升汞加5滴吐温80混合溶液浸泡12min消毒处理；消毒后用无菌水冲洗，将茎段剪成2cm的长度，茎段上剪口距芽0.5cm，下剪口距节1cm，接入初代组织培养基中；
(3)芫花外植体的培养：将步骤(2)接入初代组织培养基中的外植体置于培养室的培养架进行光照培养，温度24℃，光照强度2500lx，相对湿度75％，光周期14h昼/10h夜，培养25d直至丛生芽萌发。
实施例2
初代组织培养基：MS+0.1mg·L-1NAA+1.5mg·L-1ZT，加入蔗糖30g/L、琼脂7g/L，调整酸碱度至pH＝5.8。
培养方法：
(1)芫花外植体的选取：采集生长健壮，腋芽饱满，无病虫害的芫花当年生枝条，去除全部叶片，剪截成10cm带腋芽茎段作为外植体；
(2)芫花外植体的处理：将外植体质量体积比为0.5％洗衣粉水溶液浸泡20min，接着用流水冲洗12h，在接种室的超净工作台无菌环境下再将外植体剪成4cm茎段，采用体积比75％乙醇水溶液消毒30s，再用1g·L-1升汞加5滴吐温80混合溶液浸泡12min消毒处理；消毒后用无菌水冲洗，将茎段剪成2cm的长度，茎段上剪口距芽0.5cm，下剪口距节1cm，接入初代组织培养基中；
(3)芫花外植体的培养：将步骤(2)接入初代组织培养基中的外植体置于培养室的培养架进行光照培养，温度24℃，光照强度2500lx，相对湿度75％，光周期14h昼/10h夜，培养25d直至丛生芽萌发。本实施例芫花茎段外植体初代培养从接种到茎段腋芽萌发的生长情况，如图1所示。
实施例3
初代组织培养基：MS+0.1mg·L-1NAA+1.5mg·L-1ZT，加入蔗糖25g/L、琼脂6.5g/L，调整酸碱度至pH＝5.7。
培养方法：
(1)芫花外植体的选取：采集生长健壮，腋芽饱满，无病虫害的芫花当年生枝条，去除全部叶片，剪截成8cm带腋芽茎段作为外植体；
(2)芫花外植体的处理：将外植体用质量体积比为0.2％洗衣粉水溶液浸泡20min，接着用流水冲洗12h，在接种室的超净工作台无菌环境下再将外植体剪成5cm茎段，采用体积比70％乙醇水溶液消毒45s，再用1g·L-1升汞加3滴吐温80混合溶液浸泡10min消毒处理；消毒后用无菌水冲洗，将茎段剪成2.5cm的长度，茎段上剪口距芽0.5cm，下剪口距节2cm，接入初代组织培养基中；
(3)芫花外植体的培养：将步骤(2)接入初代组织培养基中的外植体培养室的培养架进行光照培养，温度25℃，光照强度3000lx，相对湿度75％，光周期14h昼/10h夜，培养30d直至丛生芽萌发。
实施例4
实施例4与实施例2的培养基配方和培养方法相同，不同之处在于，步骤(2)洗衣粉浸泡时间15min和流水冲洗时间10h，乙醇消毒的时间为45s，升汞加吐温80消毒的时间为14min；步骤(3)培养温度22℃，光照强度2000lx，相对湿度70％，光周期14h昼/10h夜，培养30d直至丛生芽萌发。
实施例5
实施例5与实施例2的培养基配方和培养方法相同，不同之处在于，洗衣粉浸泡时间18min和流水冲洗时间10h，乙醇消毒的时间为30s，升汞加吐温80消毒的时间为12min；步骤(3)培养温度25℃，光照强度3000lx，相对湿度75％，光周期14h昼/10h夜，培养28d直至丛生芽萌发。
实施例6
实施例5与实施例2的培养基配方和培养方法相同，不同之处在于，洗衣粉浸泡时间18min和流水冲洗时间11h，乙醇消毒的时间为40s，升汞加吐温80消毒的时间为12min，消毒后用无菌水冲洗，将茎段剪成1.5cm的长度；步骤(3)培养温度25℃，光照强度3000lx，相对湿度75％，光周期14h昼/10h夜，培养25d直至丛生芽萌发。
试验例1
消毒方法对芫花茎段外植体灭菌效果的影响。
试验相关指标计算公式如下:
污染率(％)＝外植体污染数/接种外植体总数×100；
死亡率(％)＝外植体死亡数/接种外植体总数×100；
存活率(％)＝100－污染率(％)－死亡率(％)；
萌发率(％)＝腋芽萌发的外植体数/接种外植体总数×100；
玻璃化率(％)＝玻璃化外植体数/接种外植体总数×100；
萌芽均高(cm)＝腋芽萌发的新梢基部到端部最上一节的长度之和/接种外植体总数。
试验数据采用SPSS软件进行方差分析和多重比较。
1、预处理无流水冲洗环节的消毒方法对芫花茎段外植体灭菌效果的影响：
制作MS固体培养基：称量并溶解MS培养基所需药品，加入蔗糖30g/L、琼脂7g/L，采用1mol/L的NaOH或HCl调整酸碱度至pH＝5.8；分装培养基；
采用高压蒸汽灭菌法，维持蒸汽压103.4kPa、温度121.3℃，灭菌20min。培养基水平放置，冷却后备用。
选用实施例2中茎段作为外植体，预处理采用质量体积比为0.5％洗衣粉水溶液浸泡芫花茎段外植体20min；消毒采用75％乙醇30s+1g·L-1升汞溶液8～14min进行灭菌处理。消毒后用无菌水冲洗，将茎段剪成2cm的长度，茎段上剪口距芽0.5cm，下剪口距节1cm，接入制备好的MS固体培养基；每处理30个茎段，重复3次。将接种苗置于培养室的培养架进行光照培养，保持室内温度24℃，光照强度2500lx，相对湿度75％，光周期14h昼/10h夜，培养25d。观察计算芫花茎段外植体灭菌效果，结果见表1。
表1预处理无流水冲洗环节的消毒方法对芫花茎段外植体灭菌效果的影响
注：同一列数据中字母(小写)不同者表示差异显著(P<0.05)；
由表1可知：
预处理无流水冲洗环节的消毒方法对外植体灭菌效果试验结果表明：芫花茎段外植体消毒处理污染率为87.8～100.0％，各处理无显著差异。由此可知，预处理过程中无流水冲洗环节的消毒方法，污染率极高，无法获得充足的无菌试验材料。
2、预处理加流水冲洗环节的消毒方法对芫花茎段外植体灭菌效果的影响：方法与上述1相同，不同在于预处理采用洗衣粉溶液浸泡芫花茎段外植体20min，接着用流水冲洗12h；然后采用75％乙醇30s+1g·L-1升汞加3-5滴吐温80混合溶液8～14min进行灭菌处理，结果见表2：
表2预处理加流水冲洗12h的消毒方法对芫花茎段外植体灭菌效果的影响
注：同一列数据中字母(小写)不同者表示差异显著(P<0.05)；
由表2可知：
预处理加流水冲洗环节的消毒方法其污染率随升汞吐温混合液消毒时间的延长逐渐下降。消毒8min处理的污染率为91.1％，显著高于其他各处理；消毒14min污染率最低，为44.4％；其中消毒12min与14min处理污染率差异不显著。
预处理加流水冲洗环节的消毒方法茎段外植体死亡率随升汞吐温混合液消毒时间的延长逐渐上升；消毒14min死亡率为35.6％，显著高于其他各处理；消毒8、10、12min的处理其死亡率均在13.3％以下，其差异不显著。
预处理加流水冲洗环节的消毒方法其存活率受杀菌效果和死亡情况的双重影响。从芫花茎段外植体消毒试验的存活率数据分析：消毒8min处理的存活率为5.6％，效果最差，显著低于其他处理；消毒10min和14min存活率为21.1％和20.0％；消毒12min效果最好，存活率达28.9％，显著高于其他处理。
结论：预处理采用洗衣粉溶液浸泡芫花茎段外植体20min，接着用流水冲洗12h；消毒采用75％乙醇30s+0.1％升汞吐温混合溶液10～14min的方法可获得生存率达20.0～28.9％的无菌外植体。综合分析污染率、死亡率与生存率的试验结果可知：芫花茎段外植体的最佳消毒方法为预处理采用洗衣粉溶液浸泡芫花茎段外植体20min，接着用流水冲洗12h；消毒采用75％乙醇30s+0.1％升汞吐温80混合溶液12min，其污染率为57.8％，死亡率为13.3％，存活率为28.9％。
改用洗衣粉浸泡时间15-20min、流水冲洗时间8-12h或者70-75％乙醇消毒30-45s的方法都与上述结果类似。
试验例2
不同激素与质量浓度对初代培养的影响
选用实施例1和2中腋芽茎段作为外植体并采用实施例1和2的消毒方法，预处理采用洗衣粉溶液浸泡芫花茎段外植体20min，接着用流水冲洗12h；将外植体剪成4cm茎段；消毒采用75％乙醇30s+0.1％升汞加5滴吐温80混合溶液12min，消毒后用无菌水冲洗，将茎段剪成2cm的长度，茎段上剪口距芽0.5cm，下剪口距节1cm，接入初代组织培养基中，用消毒获得的无菌带芽茎段进行初代培养试验。试验设置对照试验激素为MS+0.1mg·L-1NAA+(0.5、2.0、5.0)mg·L-16-B，以及MS+0.1mg·L-1NAA+2.0mg·L-1ZT与本发明实施例1-2采用的MS+0.1mg·L-1NAA+(1.0、1.5)mg·L-1ZT进行对比，共6个处理，并且6个处理都加入蔗糖30g/L、琼脂7g/L，调整酸碱度至pH＝5.8。接种苗置于培养室的培养架进行光照培养，保持室内温度24℃，光照强度2500lx，相对湿度75％，光周期14h昼/10h夜，培养25d。不同激素配方处理对芫花茎段外植体萌发与生长情况的影响试验结果(见表3)：
表3不同激素配方处理对芫花茎段外植体萌发与生长情况的影响
不同激素配方处理对芫花茎段外植体萌芽的影响结果表明：细胞分裂素采用6-BA处理萌芽率在16.7～34.4％，ZT处理萌芽率在74.4～92.2％，6-BA处理萌芽率显著低于ZT处理。由此可知，对芫花的初代培养激素配方中细胞分裂素采用ZT对芫花茎段外植体芽萌发的促进效果显著优于6-BA。其中MS+0.1mg·L-1NAA+1.5mg·L-1ZT处理对芫花茎段外植体芽萌发效果显著优于其他处理，萌发率达到92.2％。
不同激素配方处理对芫花茎段外植体玻璃化的影响结果表明：随着细胞分裂素6-BA与ZT浓度升高，芫花茎段外植体初代培养玻璃化现象逐渐加剧。6-BA处理玻璃化率在52.2～90.0％，ZT处理玻璃化率在17.8～42.2％，ZT处理玻璃化率显著低于6-BA处理。在不同激素配方处理中，MS+0.1mg·L-1NAA+1.0mg·L-1ZT处理与MS+0.1mg·L-1NAA+1.5mg·L-1ZT处理对芫花茎段外植体初代培养中减少玻璃化现象显著优于其他处理，玻璃化率小于22.3％。
不同激素配方处理对芫花茎段外植体萌芽平均高度的影响结果表明：6-BA处理萌芽均高在0.20～0.66cm，ZT处理萌芽均高在1.06～2.13cm，ZT处理萌芽均高显著高于6-BA处理。在不同激素配方处理中，MS+0.1mg·L-1NAA+1.0mg·L-1ZT处理与MS+0.1mg·L-1NAA+1.5mg·L-1ZT处理对芫花茎段外植体初代培养中萌芽平均高度显著优于其他处理，萌芽均高为1.67cm和2.13cm。
结论：综合不同激素配方处理对芫花茎段外植体萌发与生长情况的影响结果表明：MS+0.1mg·L-1NAA+1.5mg·L-1ZT处理为芫花茎段外植体初代培养最佳配方，其萌发率为92.2％，玻璃化率为22.3％，萌芽均高为2.13cm。改用其他实施例3-6的消毒方法以及培养条件，与实施例2的培养结果相近。
通过本发明的芫花茎段初代组织培养方法采用茎段外植体诱导丛生芽，可以简单、快捷的获得芫花组培苗，初代芫花组培苗是进行继代培养的必须材料。运用初代培养试管苗可建立茎梢、芽丛、胚状体和原球茎等无性繁殖系，可用于继代扩繁、细胞培养、种质资源保存等不同研究目的。芫花组培苗无性系建立的意义在于：1.可用于深入研究芫花生长和分化规律，并可以利用各种培养条件影响其发育进程。2.可用于优良单株的快速繁殖、无病毒种苗培育、新品种的选育、人工种子和种质资源保存。3.可用于开展基因转移与重组、药用组分定向培养等生物工程技术。