本发明涉及植物栽培领域，特别是一种杈杷果的组织培养方法。
背景技术：
：杈杷果的果实营养丰富，糖酸比高达39∶1，杈杷果可溶性糖、可溶性固形物及维生素c的含量与常见的栽培果树相近，含糖量明显高于刺梨、沙棘和猕猴桃，果实矿质原素含量极高，钙、铁、磷、氨基酸含量均高于其它果品，比苹果高出24倍，铁的含量比桃高出5倍，磷的含量已是报道过的所有果品之最，且味美爽口浓甜芳香。除食用价值外，杈杷果株形开张小巧，花开芳香，果形特异，果色红艳娇嫩透亮，晶莹剔透，鲜红如玉，具有很好的观花、观果、观叶的盆栽观赏价值。杈杷果在我国豫西秦岭余脉海拔1000米左右有零星少量分布，根系发达强健，四季均可移栽，成活率达100％，具有顽强的生命力及再生能力，且可长途运输和邮寄苗木。但是近十余年由于大量滥采滥挖，杈杷果野生资源几近枯竭，因此推动杈杷果的产业化发展急需快速进行种苗的繁殖培育及资源圃的建立。杈杷果的传统繁殖采用分枝或用枝条扦插，但这对于短时间、大规模快速繁育杈杷果仍显不足。技术实现要素：针对现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种杈杷果的组织培养方法，可大规模培育杈杷果植株幼苗。为了达到上述目的，本发明提供的技术方案如下：一种杈杷果的组织培养方法，包括以下步骤：1)选取长势良好果实粗大的植株，截取8～15mm的带芽茎段或长出不超过7日的嫩叶，用自来水清洗后放入70～75％的乙醇溶液中浸泡20～30s，取出用无菌水清洗3～5次，使用无菌纱布擦干水分后，切成0.4～0.8cm2的小块，得到外植体；2)配置营养液，放入三角烧瓶中，将步骤1)得到的外植体放入营养液，将三角烧瓶置于往复式摇床上进行培养，将摇床速度设置为60～90r/min，每隔2～3d更换一次营养液，直至长出新芽；3)将步骤2)中长出新芽的外植体放入继代培养基中，在18～24℃温度范围内进行变温培养，每日进行1～2h的二氧化碳施肥，并每日进行12h的光照，光照强度为800-1400lx，每隔3～4d更换一次继代培养基；4)将步骤3)中长出细根的外植体挑选出来，放入生根培养基中，每日更换生根培养基，并进行6～7h的光照，光照强度为3000～4000lx，培养温度为20～22℃，直至根系长到3～5cm，得到幼苗；5)将步骤4)得到的幼苗移栽到大棚中，控制棚内温度为25～28℃，光照为日光，栽培介质由细砂、蛭石、甘蔗渣、草炭土按重量比1∶1∶0.5∶0.5混合得到。优选地，步骤1)-4)均在无菌环境下进行。优选地，步骤2)中所述的营养液由以下成分组成：6-苄氨基嘌呤0.6-0.8mg/l、6-糖基氨基嘌呤0.6-0.8mg/l、iaa0.5-1mg、2，4二氯苯氧乙酸0.5-1mg/l、抗坏血酸0.08-0.1g/l、活性炭0.1-0.5g/l、大蒜汁15-25g/l，营养液主要含有细胞分裂素和生长素，另外添加的抗坏血酸和大蒜汁起到杀菌以及补充蛋白质、碳水化合物、维生素、矿物质等营养元素，添加活性炭预防外植体褐变。优选地，步骤3)中所述的继代培养基由以下成分组成：琼脂10-12g/l、聚乙烯醇0.1-0.15g/l、脱落酸0.1-0.15mg/l、甘蔗汁8-12g/l、2，4二氯苯氧乙酸2-2.2mg/l、6-苄氨基嘌呤0.4-0.6mg/l，以大量生长素和少量细胞分裂素为主，添加甘蔗汁提供能量源，添加脱落酸预防外植体玻璃化。优选地，步骤4)中所述的生根培养基由以下成分组成：iaa2-2.2mg/l、kt1.8-2mg/l、碳酸钙1.5-3g/l、硫酸镁0.2-0.3g/l、酵母粉0.4-0.6g/l、琼脂12-15g/l、牛肉膏0.3-0.4g/l，去除细胞分裂素，优化生长素的配比，添加牛肉膏等营养成分，诱导生根。优选地，步骤5)中所述的栽培介质在使用前需经过1.5-2h高温烘烤。本发明的有益效果：利用植物细胞的全能性，挑选强壮的植株作为外植体，可以大量培育具有优良基因的杈杷果幼苗，第一阶段初代培养使用营养液诱导外植体分裂，在营养液中加入抗坏血酸和大蒜汁起到杀菌以及补充蛋白质、碳水化合物、维生素、矿物质等营养元素的作用；第二阶段继代培养，每日进行二氧化碳施肥，即在培养环境中充入二氧化碳气体，并控制光照强度与光照时间，加速杈杷果外植体的生长；第三阶段以大量生长素和少量细胞分裂素为主，使用甘蔗汁提供能量源，生根效果显著；控制各个培养阶段的温度、光照、营养素等条件，短时间内可培育出大量的杈杷果植株。具体实施方式下面结合以下具体实施方式对本发明做进一步的详细描述。实施例1一种杈杷果的组织培养方法，包括以下步骤：1)选取长势良好果实粗大的植株，截取10mm的带芽茎段，用自来水清洗后放入70％的乙醇溶液中浸泡30s，取出用无菌水清洗3次，使用无菌纱布擦干水分后，切成0.5cm2的小块，得到外植体；2)配置营养液，营养液中溶质为6-苄氨基嘌呤1.5mg/l、2，4二氯苯氧乙酸1mg/l，溶剂为100ml无菌水，放入三角烧瓶中，将步骤1)得到的外植体放入营养液，将三角烧瓶置于往复式摇床上进行培养，将摇床速度设置为80r/min，每隔2d更换一次营养液，直至长出新芽；3)将步骤2)中长出新芽的外植体放入继代培养基中，继代培养基成分为：琼脂10g/l、聚乙烯醇0.1g/、葡萄糖5g/l、2，4二氯苯氧乙酸2mg/l、6-苄氨基嘌呤0.4mg/l。在18～24℃温度范围内进行变温培养，每日进行1.5h的二氧化碳施肥，并每日进行12h的光照，光照强度为1000lx，每隔3d更换一次继代培养基；4)将步骤3)中长出细根的外植体挑选出来，放入生根培养基中，生根培养基为wpm培养基，每日更换生根培养基，并进行6h的光照，光照强度为3000lx，培养温度为22℃，直至根系长到3～5cm，得到幼苗；5)将步骤4)得到的幼苗移栽到大棚中，控制棚内温度为26℃，光照为日光，栽培介质由细砂、蛭石、甘蔗渣、草炭土按重量比1∶1∶0.5∶0.5混合得到。步骤1)-步骤4)均在无菌环境下进行。实施例2一种杈杷果的组织培养方法，包括以下步骤：1)选取长势良好果实粗大的植株，截取10mm的带芽茎段，用自来水清洗后放入70％的乙醇溶液中浸泡30s，取出用无菌水清洗3次，使用无菌纱布擦干水分后，切成0.5cm2的小块，得到外植体；2)配置营养液，在100ml无菌水中加入6-苄氨基嘌呤1.5mg/l、2，4二氯苯氧乙酸1mg/l、活性炭0.2g/l，放入三角烧瓶中，将步骤1)得到的外植体放入营养液，将三角烧瓶置于往复式摇床上进行培养，将摇床速度设置为80r/min，每隔2d更换一次营养液，直至长出新芽；3)将步骤2)中长出新芽的外植体放入继代培养基中，继代培养基为wpm培养基+naa0.1mg/l，在18～24℃温度范围内进行变温培养，每日进行1.5h的二氧化碳施肥，并每日进行12h的光照，光照强度为1000lx，每隔3d更换一次继代培养基；4)将步骤3)中长出细根的外植体挑选出来，放入生根培养基中，生根培养基成分为：iaa2mg/l、kt1.8mg/l、碳酸钙2g/l、硫酸镁0.2g/l、琼脂12-15g/l，每日更换生根培养基，并进行6h的光照，光照强度为3000lx，培养温度为22℃，直至根系长到3～5cm，得到幼苗；5)将步骤4)得到的幼苗移栽到大棚中，控制棚内温度为26℃，光照为日光，栽培介质由细砂、蛭石、甘蔗渣、草炭土按重量比1∶1∶0.5∶0.5混合得到。步骤1)-步骤4)均在无菌环境下进行。实施例3一种杈杷果的组织培养方法，包括以下步骤：1)选取长势良好果实粗大的植株，截取10mm的带芽茎段，用自来水清洗后放入70％的乙醇溶液中浸泡30s，取出用无菌水清洗3次，使用无菌纱布擦干水分后，切成0.5cm2的小块，得到外植体；2)配置营养液，营养液由以下成分组成：6-苄氨基嘌呤0.6mg/l、6-糖基氨基嘌呤0.6mg/l、iaa0.5mg、2，4二氯苯氧乙酸0.5mg/l、抗坏血酸0.08g/l、活性炭0.1g/l、大蒜汁15g/l，放入三角烧瓶中，将步骤1)得到的外植体放入营养液，将三角烧瓶置于往复式摇床上进行培养，将摇床速度设置为80r/min，每隔2d更换一次营养液，直至长出新芽；3)将步骤2)中长出新芽的外植体放入继代培养基中，继代培养基由以下成分组成：琼脂10g/l、聚乙烯醇0.1g/l、脱落酸0.1mg/l、甘蔗汁8g/l、2，4二氯苯氧乙酸2mg/l、6-苄氨基嘌呤0.4mg/l，在18～24℃温度范围内进行变温培养，每日进行1.5h的二氧化碳施肥，并每日进行12h的光照，光照强度为1000lx，每隔3d更换一次继代培养基；4)将步骤3)中长出细根的外植体挑选出来，放入生根培养基中，生根培养基的成分为：iaa2.1mg/l、kt1.8mg/l、碳酸钙1.8g/l、硫酸镁0.25g/l、酵母粉0.5g/l、琼脂13g/l、牛肉膏0.35g/l，每日更换生根培养基，并进行6h的光照，光照强度为3000lx，培养温度为22℃，直至根系长到3～5cm，得到幼苗；5)将步骤4)得到的幼苗移栽到大棚中，控制棚内温度为25～28℃，光照为日光，栽培介质由细砂、蛭石、甘蔗渣、草炭土按重量比1∶1∶0.5∶0.5混合得到。步骤1)-4)均在无菌环境下进行。表1实施例1～3各个阶段情况对比实施例长出新芽耗时/h生根用时/h成苗率/％实施例1283693.81实施例2273094.14实施例3222899.47采用本发明的组织培养方法得到的杈杷果幼苗存活率均较高，以实施例3为最优选实施方案。以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不是对本发明专利范围的限制，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12