本发明属于转基因家蚕技术领域，尤其涉及一种通过即时电晕制作滞育性转基因家蚕的方法。
背景技术：
家蚕是重要的经济昆虫和鳞翅目昆虫模式生物。家蚕有一个重要的生理现象是化性，即一年中发生的世代数。一化性蚕品种一年只经历一个世代，然后产下的卵进入一个漫长的滞育期，直到第二年在合适的温湿度条件下解除滞育开始发育；二化性家蚕品种一年内在自然环境中发生两代，浸泡盐酸法可人工解除滞育控制繁殖代数；多化性家蚕品种，一年内发生三代以上，非滞育性多化种没有滞育期。二化性家蚕品种幼虫生长期、蚕茧大小介于一化与多化蚕品种之间，其体质、茧丝质性状等也很适合蚕业生产所需的平衡要求，所以蚕业生产普遍使用二化性滞育卵，形成了生产性状优良、品种丰富的二化性品种群体。
自2000年日本科学家首次成功培育转基因家蚕以来，转基因家蚕成功的报道逐渐增多。绝大多数转基因试验都是利用多化性家蚕品种，但多化性家蚕品种经济性状差，利用家蚕滞育性品种进行转基因研究可以克服多化性家蚕品种在转基因研究中的诸多缺陷。家蚕滞育性品种的转基因研究具有极为重要的意义。家蚕滞育品种在产卵以后便进入滞育期，滞育卵一般在产卵后约16-20小时左右利用常规的即时浸酸法或者经过长期的低温冷藏方法解除滞育开始孵化。但是，目前最有效的家蚕转基因显微注射时间是在产卵后3-6小时，转基因操作后卵上会留下注射小孔，如果在注射后利用常规的即时浸酸法会导致盐酸渗入蚕卵内，使其死亡，根本无法实现家蚕滞育品种的转基因研究；转基因注射留下的小孔也使得蚕卵不能长期放置，所以不能采用长期低温冷藏方法解除滞育。因此，家蚕滞育品种卵的滞育，给转基因操作带来很大的限制。
目前，利用滞育性家蚕品种进行转基因的方法主要有以下几种，它们各存缺陷：
(1)西南大学赵爱春等探索了在蚕卵受精后立即进行浸酸的方法并成功的获得相应的转基因方法(家蚕滞育品种的早期浸酸转基因方法，专利号200710303904.1，公开日2008年06月11日)。然而，由于该法需要浸酸，显微注射后孵化率较低，而且早期浸酸的效果在品种间的差异比较大。
(2)西南大学赵爱春等还利用特殊的催青条件改变家蚕滞育品种下一代蚕卵的化性，并结合常规的家蚕转基因技术，有效制作出转基因蚕(家蚕滞育种的低温催青转基因方法，专利号200710303903.7，公开日2008年06月11日)。虽然该法在注射后孵化率与多化性蚕卵不相上下，但是低温催青的效果在品种间的差异非常大，对一化性和日系二化性蚕品种基本上不适用。
(3)西南大学马三垣等利用亲代所处环境条件与子代蚕卵滞育性的关系，使亲代家蚕在经严格控制的特殊环境条件下进行催青、饲养和种茧保护，并采用适当的交配方式以获得非滞育的子代蚕卵，进行转基因注射，获得转基因蚕(家蚕滞育品种的转基因方法，专利号200910103397.6，公开日2009年08月12日)。该法一定程度上解决了日系二化性蚕品种无法进行转基因注射的难题，但日系品种仍然解除滞育率不高，且亲代家蚕需在恒温、恒湿、绝对黑暗等严苛的环境下催青、饲养和种茧保护，试验条件要求高、成本大；催青温度只有15℃，需要一个多月的催青时间；养蚕温度也不高，蚕生长发育所需时间长，大大延长了转基因试验的周期；这种养蚕、制种方式与生产实际相差大，对后代的强健性有很大影响，幼虫成活率低。
(4)苏州大学徐世清等利用亲代蚕卵催青孵化时期的保护温度与光制组合，以及对子代受精前蚕卵的人工孵化处理，获得早期活化卵，然后进行常规显微注射并进行筛选，获得转基因蚕卵的方法(一种家蚕二化性品种卵转基因用蚕卵的制备方法，专利号200910212990.4，公开日2010年05月12日)。该方法将低温催青(20℃)、全龄光照饲养与早期浸酸相结合，一定程度上提高了孵化率，但仍然存在上述操作复杂、试验周期长等问题。
(5)西南大学龚竞等将转基因处理后的滞育性蚕卵置于密闭环境中进行充氧处理，以解除滞育(一种阻断转基因家蚕卵滞育的方法，专利申请号201610569284.5，公开日2016年12月07日)。该法在密闭的设备中进行长时间的充氧(10-50h)，实验要求高；而且前人的研究论文中也发现氧气或臭氧解除家蚕卵滞育性的效果不稳定。
因此，探索一种省时、省力、技术要求低，又能适用于所有滞育性家蚕品种的转基因方法，仍然是实现转基因家蚕成果快速应用到蚕桑产业的迫切需求。
使用电场刺激解除家蚕滞育性在上世纪90年代是中国蚕业界的一个研究热点，日本学者星野等(1914)用感电方法解除蚕卵的滞育，曾获得90％以上的孵化率，但因感电孵化蚕的体质弱而未得到实用。杨明观等(1994)对各种蚕种进行了系统的电晕人工孵化试验，取得较好的结果，孵化率与浸酸方法的结果一样；他们后续的研究还发现，电晕处理人工孵化蚕的生长发育、生命率及蚕茧产量品质均与对照无实质性差异，电晕不会给蚕的饲养带来不良影响。而且，即浸种和冷藏种均可以采用电晕的方法解除滞育。但当时的研究者发明电晕解除家蚕滞育性的方法，是为了解决蚕茧生产过程中的浸酸带来的环境污染与成本问题，而且在生产应用中遇到放电不匀等难题无法解决而没有得到推广与利用，后续也没有人再进行研究。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种操作简单方便、成本低效率高、安全无污染且适用于各种家蚕品种的通过即时电晕制作滞育性转基因家蚕的方法。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
通过即时电晕制作滞育性转基因家蚕的方法，利用高压电场对转基因注射后的滞育性家蚕卵进行即时电晕刺激使其解除滞育，直接进入孵化期。
高压电场来自电晕仪，电晕仪主要由电源和正、负极板组成，电源的输出端分别通过连接线连接正、负极板，正、负极板通过绝缘杆相互平行间隔地安装在底座上，负极板上放置有蚕卵金属载片，正极板上设有垂直蚕卵金属载片的极针。
正、负极板规格为15cm×8cm，正、负极板间隔15mm，极针长10mm，针距8mm。
高压电场为8.0-12kv，即时电晕刺激时间为10s-4min。
转基因注射的基因为羊毛角蛋白3.2基因、羊毛角蛋白4.3基因、橙黄色荧光蛋白基因、羊毛角蛋白5.4基因。
滞育性家蚕卵来自家蚕滞育性中系品种或日系品种。
滞育性家蚕卵来自家蚕滞育性中系品种“932”、日系品种“7532”或日系品种“大造”。
上述通过即时电晕制作滞育性转基因家蚕的方法，包括以下步骤：
<1>按常规催青方法催青蚕种；
<2>按常规方法饲养；
<3>熟蚕转移到25℃的环境中上簇、结茧，化蛹后采下茧，用刀销开辨认雌雄，分开放置，待其化蛾后交配4h拆对，将雌蛾投放于上浆的蚕种纸上产卵，每间隔1h收集一次蚕卵，并将收集的蚕卵置于25℃的环境中保护；
<4>将蚕卵连同蚕种纸片用自来水冲洗以后，于蒸馏水中浸泡2-3min，而后用镊子将蚕卵转移至用75％酒精消毒的蚕卵金属载片上，并按照蚕卵腹面向右的标准将其排列整齐，排列好的蚕卵置于35-37％的甲醛蒸气中消毒5min；
<5>以收集蚕卵时间开始记时，于收集后3-6h用显微注射仪将10-15nl、总浓度400ng/μl的转座载体质粒从蚕卵腹面中央注入已经消毒的蚕卵中，并用无毒的胶水封闭卵壳上注射留下的小孔；
<6>注射完的蚕卵置于35-37％的甲醛蒸气中消毒5min，放25℃的环境中保护；
<7>以收集蚕卵时间开始记时，将带有注射过蚕卵的蚕卵金属载片在20-40h之间放到电晕仪上，8.0-12kv刺激10s-4min；
<8>电击处理后的蚕卵，置于温度25-28℃，相对湿度80-90％的条件下，进行催青直到孵化，饲养孵化出来的蚁蚕，将当代g0的蚕蛾进行自交或回交，获得滞育性的g1代蚕卵，g1代蚕卵经即时电晕处理后于转青期在荧光显微镜下扫描筛选获得转基因个体；最后将获得的转基因个体正常饲养、继代。
针对现有转基因家蚕制备存在的问题，发明人建立了一种通过即时电晕制作滞育性转基因家蚕的方法，利用高压电场对转基因注射后的滞育性家蚕卵进行即时电晕刺激使其解除滞育，直接进入孵化期。应用本发明处理后，经荧光检测筛选阳性个体饲养继代，能有效地解决了家蚕滞育品种进行转基因操作烦琐、效率低等难题。研究表明，本发明电晕处理蚕卵孵化率高达99％，中系和日系品种效果一样好，而且对后期蚕的生长发育、结茧等经济性状均无影响。总之，本发明操作简单方便、成本低效率高、安全无污染且适用于各种家蚕品种，为转基因家蚕的制备提供有力的技术支持。
目前保存的表型突变和生理突变家蚕遗传资源绝大多数都是滞育种，本发明为研究和利用这些宝贵的遗传资源奠定了坚实的技术基础。而且，转基因技术已经在果蝇、伊蚊、蜜蜂等20余种昆虫中建立，但是大多数报道均是多化性非滞育性品种，本发明也将为其他卵滞育性的鳞翅目昆虫转基因技术的建立提供有用借鉴和参考。
附图说明
图1是发明人为实施本发明而自制的gz-01型电晕仪的结构示意图。
图中：1金属外壳，2电源开关，3电压调节器，4电压显示器，5电源线，6正极板，7负极板，8正极连接线，9负极连接线，10绝缘杆，11极针，12粘有蚕卵的蚕卵金属载片，13底座。
具体实施方式
以下结合实例详细说明本发明如何实施。
其中，图1显示了发明人为实施本发明而自制的gz-01型电晕仪，电晕仪主要由电源和正、负极板组成，电源的输出端分别通过连接线连接正、负极板，正、负极板通过绝缘杆相互平行间隔地安装在底座上，负极板上放置有蚕卵金属载片，正极板上设有垂直蚕卵金属载片的极针。金属外壳规格为20×12cm；电压显示器可显示0-15kv；电源线接家用220v交流电。正、负极板规格为15cm×8cm，正、负极板间隔15mm，极针长10mm，针距8mm。该电晕仪可产生0-15kv的高压电场，即时电晕刺激时间为10s-4min。
以下各例均使用自制的gz-01型电晕仪。
实施例1
利用家蚕滞育性中系品种“932”作为原始材料，将正常饲养所得的蚕卵在按生产上使用的常规催青方法催青蚕种：温度27℃，相对湿度85％。为了使孵化整齐，蚕种点青后用黑布包好蚕种，两天后取出蚕种进行收蚁。按常规方法饲养收获的蚁蚕：小蚕期(1-3龄)25-28℃，相对湿度75-85％；大蚕期(4-5龄)23-26℃，相对湿度70-80％，通风换气；全龄采用自然光照，一日三回饲喂桑叶即可。或者全龄在常温下饲养也可以。熟蚕转移到25℃左右的环境中上簇、结茧，化蛹后采下茧，用刀销开辨认雌雄，分开放置，待其化蛾后交配4h拆对，将雌蛾投放于上浆的蚕种纸上产卵，每间隔1h收集一次蚕卵，并将收集的蚕卵置于25℃的环境中保护。将蚕卵连同蚕种纸片用自来水冲洗以后，于蒸馏水中浸泡2-3min，而后用镊子将蚕卵转移至用75％酒精消毒的蚕卵金属载片(规格：76×26mm，厚度为3mm)上，并按照蚕卵腹面向右的标准将其排列整齐，排列好的蚕卵置于35-37％的甲醛蒸气中消毒5min。以收集蚕卵时间开始记时，于收集后3-6h用显微注射仪将10-15nl、总浓度400ng/μl的转座载体质粒从蚕卵腹面中央注入已经消毒的蚕卵中，并用无毒的胶水封闭卵壳上注射留下的小孔。注射完的蚕卵置于35-37％的甲醛蒸气中消毒5min，放25℃的环境中保护。以收集蚕卵时间开始记时，将带有注射过蚕卵的蚕卵金属载片在20-40h之间放到自制gz-01型电晕仪上，10kv刺激10s。电击处理后的蚕卵，置于温度25-28℃，相对湿度80-90％的条件下，进行催青直到孵化，饲养孵化出来的蚁蚕，将当代(g0)的蚕蛾进行自交或回交，获得滞育性的g1代蚕卵，g1代蚕卵经即时电晕处理后于转青期在荧光显微镜下扫描筛选获得转基因个体；最后将获得的转基因个体正常饲养、继代，即完成滞育性家蚕品种“932”的转基因蚕的制备。使用该品种共进行了4次试验，获得了三个携带不同基因的转基因蚕品种，结果见表1。
表1滞育性家蚕品种“932”的即时电晕转基因试验
备注：pbac{3×p3-dsred}为携带神经和眼睛特异启动子启动的红色荧光蛋白标记的piggybac载体；pbac{3×p3-egfp}为携带神经和眼睛特异启动子启动的绿色荧光蛋白标记的piggybac载体；b2、b3、v1和b5分别携带不同的目的基因，b2为羊毛角蛋白3.2基因，b3为羊毛角蛋白4.3基因，v1为橙黄色荧光蛋白基因(mko)，b5为羊毛角蛋白5.4基因。
实施例2
利用家蚕滞育性日系品种“7532”作为原始材料，将正常饲养所得的蚕卵在按生产上使用的常规催青方法催青蚕种：温度27℃，相对湿度85％。为了使孵化整齐，蚕种点青后用黑布包好蚕种，两天后取出蚕种进行收蚁。按常规方法饲养收获的蚁蚕：小蚕期(1-3龄)25-28℃，相对湿度75-85％；大蚕期(4-5龄)23-26℃，相对湿度70-80％，通风换气；全龄采用自然光照，一日三回饲喂桑叶即可。或者全龄在常温下饲养也可以。熟蚕转移到25℃左右的环境中上簇、结茧，化蛹后采下茧，用刀销开辨认雌雄，分开放置，待其化蛾后交配4h拆对，将雌蛾投放于上浆的蚕种纸上产卵，每间隔1h收集一次蚕卵，并将收集的蚕卵置于25℃的环境中保护。将蚕卵连同蚕种纸片用自来水冲洗以后，于蒸馏水中浸泡2-3min，而后用镊子将蚕卵转移至用75％酒精消毒的蚕卵金属载片(规格：76×26mm，厚度为3mm)上，并按照蚕卵腹面向右的标准将其排列整齐，排列好的蚕卵置于35-37％的甲醛蒸气中消毒5min。以收集蚕卵时间开始记时，于收集后3-6h用显微注射仪将10-15nl、总浓度400ng/μl的转座载体质粒(pbac{3×p3-dsred}-b5，b5为羊毛角蛋白5.4基因)和辅助质粒(pha3pig)从蚕卵腹面中央注入已经消毒的蚕卵中，共注射513粒蚕卵，并用无毒的胶水封闭卵壳上注射留下的小孔。注射完的蚕卵置于35-37％的甲醛蒸气中消毒5min，放25℃的环境中保护。以收集蚕卵时间开始记时，将带有注射过蚕卵的蚕卵金属载片在20-40h之间放到自制gz-01型电晕仪上，11kv刺激15s。电击处理后的蚕卵，置于温度25-28℃，相对湿度80-90％的条件下，进行催青直到孵化，饲养孵化出来的410头蚁蚕，将当代(g0)的蚕蛾进行自交或回交，获得滞育性的112圈g1代蚕卵，g1代蚕卵经即时电晕处理后于转青期在荧光显微镜下扫描筛选获得38圈转基因阳性蛾圈，转化率为33.9％；最后将获得的转基因个体正常饲养、继代，即完成滞育性家蚕品种“7532”的转基因蚕的制备。
实施例3
利用家蚕滞育性日系品种“大造”作为原始材料，将正常饲养所得的蚕卵在按生产上使用的常规催青方法催青蚕种：温度27℃，相对湿度85％。为了使孵化整齐，蚕种点青后用黑布包好蚕种，两天后取出蚕种进行收蚁。按常规方法饲养收获的蚁蚕：小蚕期(1-3龄)25-28℃，相对湿度75-85％；大蚕期(4-5龄)23-26℃，相对湿度70-80％，通风换气；全龄采用自然光照，一日三回饲喂桑叶即可。或者全龄在常温下饲养也可以。熟蚕转移到25℃左右的环境中上簇、结茧，化蛹后采下茧，用刀销开辨认雌雄，分开放置，待其化蛾后交配4h拆对，将雌蛾投放于上浆的蚕种纸上产卵，每间隔1h收集一次蚕卵，并将收集的蚕卵置于25℃的环境中保护。将蚕卵连同蚕种纸片用自来水冲洗以后，于蒸馏水中浸泡2-3min，而后用镊子将蚕卵转移至用75％酒精消毒的蚕卵金属载片(规格：76×26mm，厚度为3mm)上，并按照蚕卵腹面向右的标准将其排列整齐，排列好的蚕卵置于35-37％的甲醛蒸气中消毒5min。以收集蚕卵时间开始记时，于收集后3-6h用显微注射仪将10-15nl、总浓度400ng/μl的转座载体质粒(pbac{3×p3-dsred}-b2，b2为羊毛角蛋白3.2基因)和辅助质粒(pha3pig)从蚕卵腹面中央注入已经消毒的蚕卵中，共注射438粒蚕卵，并用无毒的胶水封闭卵壳上注射留下的小孔。注射完的蚕卵置于35-37％的甲醛蒸气中消毒5min，放25℃的环境中保护。以收集蚕卵时间开始记时，将带有注射过蚕卵的蚕卵金属载片在20-40h之间放到自制gz-01型电晕仪上，10.5kv刺激30s。电击处理后的蚕卵，置于温度25-28℃，相对湿度80-90％的条件下，进行催青直到孵化，饲养孵化出来的382头蚁蚕，将当代(g0)的蚕蛾进行自交或回交，获得滞育性的98圈g1代蚕卵，g1代蚕卵经即时电晕处理后于转青期在荧光显微镜下扫描筛选获得35圈转基因阳性蛾圈，转化率为35.7％；最后将获得的转基因个体正常饲养、继代，即完成滞育性家蚕品种“大造”的转基因蚕的制备。
实践表明，与现有技术相比，本发明具有以下突出优点：
<1>本发明首次将电晕解除蚕卵滞育技术与家蚕转基因方法相结合，巧妙地突破了家蚕滞育品种转基因技术的瓶颈，克服了之前有关家蚕滞育种转基因方法的缺陷。而且试验也表明，解除滞育效率高、稳定性强，效果与常用的浸酸方法相媲美，对后期蚕体的生长发育等也均无影响。
<2>本发明中蚕卵的催青、饲养及解除滞育均比前人的方法简单、易操作，家蚕的饲养均可采用常温常湿的环境下桑叶饲喂即可，为常规的饲养方法，无须特殊设备与处理，与生产实际相一致。与现有的低温催青方式饲养相比，极大程度的降低了饲养成本、简化了饲养操作。
<3>本发明中蚕种催青最多只要8天，比低温催青(30天以上)缩短了20多天，能高效率的获得试验材料，大大缩短了试验周期。而且经过低温催青的蚕卵孵化以后蚕体弱、难饲养、健康性不佳，本发明中饲养的蚕与生产实际一致，孵化齐一、蚕体健康、容易饲养。
<4>通过转基因注射后的蚕卵只需要放到自制gz-01型电晕仪上，8.0-12kv高压电场刺激10s-4min，即可解除滞育，然后按常规方式进行催青筛选，与使用浸泡盐酸解除滞育的方式相比安全、无污染。
<5>现有制备转基因蚕的方法，均对中系品种效果好，但日系品种效果不佳；而本发明适用于所有的滞育性家蚕品种，日系、中系的效果均一样好。
<6>自制gz-01型电晕仪虽然工作原理与前人报道一致，但电压调节范围广且能连续调节，机器小巧、轻便、易控制和操作。通过试验研究，gz-01型电晕仪能保证工作区域电场均匀，较好的达到目标需求。