一种高温诱导大鲵雄性化的方法与流程

本发明属于水产养殖技术领域，更具体涉及一种诱导大鲵雄性化的生长方法。

背景技术：

中国大鲵(Andrias davidianus)别名“娃娃鱼”，全球现存最大的淡水两栖动物。据历史记载，野生大鲵在我国四川，湖北，云南等多省有分布，由于人类的捕杀以及栖息地的破坏，野生大鲵种群数量锐减。中国大鲵是一种食用与药用价值极高的经济动物，风味独特，具有滋阴补肾、补血行气的功效(张神虎,2001)，被誉为“水中人参”(侯进慧等,2004)。为保护和利用大鲵资源，上世纪60年代起，国内科技工作者开始探索大鲵人工繁殖技术，通过近30余年的探索研究，大鲵人工繁殖已取得初步成功(刘鉴毅等，1999)。近年来，随着大鲵人工繁育技术的不断成熟与完善，大鲵养殖业也应运而生，并逐渐向规模化、集约化发展，成为一项新兴养殖业。然而，要做好大鲵的人工繁育工作，参繁亲本需要合理的性比搭配，在繁殖中发现雄性大鲵多数少精或是无精，导致出苗率较低；此外，同龄雄性大鲵较雌鲵生长快至少30％。因此培育大量的雄性大鲵将会对大鲵繁殖工作提供巨大帮助，也能提高大鲵产量，还能为后续全雄性大鲵培育奠定基础。

以往的研究结果表明，当环境温度升高到一定范围时能导致两栖动物雌性向雄性转变，如30-31℃高温能使雌性西班牙有肋蝾螈(Pleurodeles waltl)向雄性转变(Dournon and Houillon，1985)；疣螈(Triturus cristatus)在12-26度饲养时雌雄比例无显著性差异，温度升高至28度时雄性率显著性高于雌性(Wallace H.1987)。迄今，有关大鲵高温诱导雄性化的温度以及技术研究在国内均未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的是在于提供了一种高温诱导大鲵雄性化的方法，方法易行，操作简便，通过研究环境因子(如温度等)对大鲵性腺发育与性别分化的影响，弄清了高温诱导大鲵雄性化的温度，建立了一种高温诱导大鲵雄性化，解决了目前生产上雄性大鲵多数少精或是精子质量较差导致有效参繁雄性亲本缺乏以及为后续大鲵性别控制和全雄育种一种技术手段。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

本发明的技术构思是：A、中国大鲵性腺分化起始时间确定；B、中国大鲵高温致死温度的确定；C、鉴定中国大鲵不同温度下的生理性比；D、性别相关基因高温处理卵巢表达模式分析。通过以上技术构思提供一种高温诱导大鲵雄性化的实验方法。

一种高温诱导大鲵雄性化的方法，其步骤是：

A、中国大鲵性腺分化起始时间的确定：利用组织切片结合显微镜观察，对中国大鲵不同发育时期性腺进行组织学观察；在18－22℃饲养条件下，出膜88－98天发现性腺开始分化，出膜208－212天雌雄性腺分化完成。因此，确定了中国大鲵温度(20℃、24℃、28℃、30℃、32℃)诱导起始时间应该为出膜后50－90天。

B、中国大鲵高温致死温度的确定：出膜后50－240天对中国大鲵进行不同温度(20℃、24℃、28℃、30℃、32℃)持续处理178－182天，不同温度计算存活率与死亡率。结果显示，高温30℃、32℃死亡率为100％，对照组20℃死亡率在7.5％-10％,24℃死亡率在15％-20％，28℃组死亡率在35％-42.5％。结果表明，30℃为大鲵的致死温度。

C、鉴定中国大鲵不同温度(20℃、24℃、28℃)下的表型性比：待温度处理幼鲵生长至1年龄至1.5年龄时采集处理后鱼苗性腺，进行组织学鉴定表型性别。结果显示，30℃、32℃高温导致大鲵全部死亡，28℃导致大鲵雄性率高达63.6％-70.5％，20℃与24℃时雌雄大鲵性比未显著性偏离1:1。

D、性别相关基因在不同温(20℃、24℃、28℃)处理卵巢表达模式分析：利用大鲵性别标志基因Ftz-f1(雄性)与Foxl2(雌性)进行不同温度(20℃、24℃、28℃)处理下卵巢相对定量表达分析，结果显示：Ftz-f1基因在温度24℃与28℃时，卵巢中表达量显著高于20℃；Foxl2基因表达量在28℃时显著下调，表明高温诱导大鲵过程中卵巢有向雄性化发展趋势。

在繁殖过程中，参繁亲本性比的合理搭配尤为重要，然而在繁殖中发现雄性大鲵多数少精或是无精，导致出苗率较低；此外，同龄雄性大鲵较雌鲵生长快至少30％。因此培育大量的雄性大鲵将会对大鲵繁殖工作提供了巨大帮助，也能提高大鲵产量，还能为后续全雄性大鲵培育奠定了基础。常温(20℃)养殖条件大鲵雄性率为43.7-53.3％，本技术通过高温诱导提高大鲵雄性率至63.6-70.5％，提高了参繁雄鲵比例与大鲵产量。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

本发明确定了中国大鲵性腺分化起始时间为出膜后90天左右，获得中国大鲵致死养殖温度为30℃，更重要的是筛选到了中国大鲵雄性化适宜温度(28℃)，在此温度下诱导能提高雄性率至63.6-70.5％，首次建立了大鲵雄性化的技术方法。该方法具有简单、易行、可靠等特点，为中国大鲵繁育、性别控制以及全雄性大鲵培育提供一条途径。

附图说明

图1为一种中国大鲵胚后不同时间性腺发育组织切片观察示意图。

1.出膜后48天；2.出膜后62天；3.出膜后98天；4.130天；5.170天；6.210天卵巢；7.210天精巢；8.270天卵巢；9.270天精巢；10.360天精巢；11.360天精巢；12.545天卵巢；13.545天精巢；14.3年卵巢；15.3年精巢。

GC:生殖细胞；SC:体细胞；GrC:粒层细胞；PF:原始卵泡；SL:精小叶；Sp:精原细胞；FC:滤泡腔；SeC:支持细胞；PS:初级精母细胞；Oo:卵母细胞。

图2为一种高温处理后Foxl2基因与Ftz-f1基因在卵巢中表达分析示意图。

A.高温诱导后Foxl2基因在卵巢中表达量较对照组显著性低(P<0.05)(不同字母表示显著性差异)；

B.高温诱导后Ftz-f1基因在卵巢中表量较对照组显著性高(P<0.05)(不同字母表示显著性差异)。

具体实施方式

实施例1：

本发明技术内容主要是高温诱导大鲵雄性化的方法：它的技术内容包括：1.中国大鲵性腺分化起始时间确定；2.中国大鲵高温致死温度的确定；3.鉴定中国大鲵不同温度下的生理性比；4.性别相关基因在高温处理卵巢表达模式分析。

一种高温诱导大鲵雄性化的方法，其步骤是：

A、中国大鲵性腺分化起始时间确定：选取健康的雌雄大鲵作为繁育亲本，雌雄大鲵分别按照体重注射外源激素进行催产，雄性较雌性早一天注射，雄性注射外源激素5天后进行排精处理，雌性注射外源激素4天后进行排卵处理，将收集的精子与卵子进行人工受精。在20℃孵化35天后出膜，在出膜后48、62、98、130、170、210、270、360、545天与3年分别进行取样5-20尾，4％多聚甲醛进行固定24小时后，换成70％乙醇保存。通过石蜡组织切片对中国大鲵进行性腺分化组织学观察，出膜48天的幼鲵，生殖腺位于中肾中部，生殖细胞较大且1或2个位于生殖腺中央，周围被一层体细胞包围(图1-1)；出膜62天幼鲵与48天相比变化不大，原始生殖腺约有变大，生殖细胞仍有1或2个，周围体细胞变多(图1-2)；出膜98天，原始生殖腺稍有变大，生殖细胞从体壁游离出来，生殖细胞开始有丝分裂，数量明显增多，标志生殖细胞以开始分化(图1-3)；出膜130天，生殖腺明显增大，生殖细胞增多，被一层体细胞包围(图1-4)；出膜170天，生殖腺较130天明显变大，生殖细胞增多(图1-5)；出膜210天，卵巢中可见原始卵泡形成，生殖细胞被少量颗粒细胞包围(图1-6)，精巢中可见位于体壁处的较大的精原细胞，染色较深以及位于中央的初级精母细胞被少量的支持细胞包围(图1-7)。因而认为中国大鲵组织学性腺分化开始于出膜后90天左右，至出膜后210天性腺分化完成。由于温控诱导要在性腺分化起始之前，温度诱导中国大鲵性腺分化最佳时期为出膜后50或60或70或80或90天。

B、中国大鲵高温致死温度的确定：根据大鲵性腺发育组织切片显微观察结果显示，大鲵性腺发育起始于出膜后90天左右，第一次实验(2014年)对出膜70天大鲵进行不同温度(20℃、24℃、28℃、30℃、32℃)诱导至性腺发育完全完成(出膜后240天)，每组大鲵60尾，每个温度(20℃、24℃、28℃)组设置一个重复(30℃，32℃无重复)，计算各实验组存活率；第二次实验(2015年)对出膜55天大鲵进行不同温度(24℃，28℃)诱导，每个实验组两个平行，每组200尾，诱导至出膜240天，计算各实验组存活率，结果如表1所示：对照组死亡率在7.5％-10％,24℃死亡率在15％-20％，28℃组死亡率在35％-42.5％，当温度升高至30℃与32℃幼鲵死亡率100％。结果表明，随温度增加死亡率增高，30℃为大鲵致死温度。

表1.不同温度诱导大鲵存活率统计

C、鉴定中国大鲵不同温度下的表型性比：在出膜后50-240天，分别采用20℃、24℃、28℃恒温水温饲养中国大鲵仔鲵。至出膜后240天折除温度诱导，常温养殖至1年龄至1.5年龄对各组进行样本采集，将性腺用4％(质量体积比)多聚甲醛固定24小时后，换成70％(体积比)乙醇保存。经各级乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、连续切片以及HE染色，显微观察组织结构简单表型性别。2014年对大鲵仔鲵进行预实验获得高温28℃66.6-70.5％的雄性大鲵，24℃与对照组分别获得47.1-57.1％与43.7-53.3％的雄性大鲵。2015年，扩大实验鱼总数进行重复实验，获得高温28度雄性大鲵比例63.6-66.6％，24℃50-54.2％，对照组50-51.8％。将两年实验数据进行生物统计学综合分析，结果表明28℃高温雄性比例显著性高于24℃组与对照组(P<0.05)；24度组雄性比例与对照组未见显著性差异(P>0.05)。

表2.不同温度大鲵性比分析

D、性别相关基因在高温处理卵巢表达模式分析：选取中国大鲵雌雄性别标志基因Ftz-f1与Foxl2对高温(24℃与28℃)诱导过程中雌性性腺进行表达水平检测鉴定。根据Ftz-f1与Foxl2基因序列设计相对定量PCR引物如下：Ftz-f1-S：CAGTGGATTATGACAGAAGTCCGTA；Ftz-f1-A：GGTCTCGGGAATGTCAGGGTA；Foxl2-S：GGTAGCCGTAGCTGTCGCTG；Foxl2-A：AGAACAGCATCCGCCACAAC。选取β-actin基因作为内参基因进行定量PCR分析，引物序列如下：β-Actin-A:GGTTATGCCCTGCCTCACG；β-Actin-S:ATTTCCCTTTCGGCTGTGG。利用以制备好的cDNA为模板,每个组织3个个体重复3次。采用TaKaRa公司的SYBR ExScript RT-PCRKit,20μL的反应体系:10μL SYBR Premix ExTaq(2×),0.4μL GHR-S1,0.4μL GHR-A1,1μL cDNA和0.4μL ROX reference dye。在Rotor-Gene6000Real-time PCR仪(Qiagen,Germany)上进行荧光定量PCR反应。所得数据用SPSS19.0软件进行单因素方差下(One-Way ANOVA),Duncan’s法进行多重比较分析,当P<0.05时认为差异显著。结果显示，在高温(24℃与28℃)诱导中Foxl2基因在卵巢中表达量显著性下调，Ftz-f1表达量显著性上调，表明高温(24℃与28℃)在诱导雄性化过程中能下调雌性基因Foxl2的表达，上调雄性基因Ftz-f1表达(图2)。高温诱导大鲵过程中卵巢有向雄性化发展趋势。