TALE蛋白AvrXa7在防治柑橘溃疡病害上的应用的制作方法

本专利属生物技术领域，涉及tale蛋白avrxa7在防治柑橘溃疡病害上的应用。avrxa7来源于水稻白叶枯病菌，对柑橘溃疡病菌中的ptha4致病功能有抑制作用，干扰柑桔中感病基因的表达，从而有效控制柑橘溃疡病害发生。

背景技术：

柑橘溃疡病是我国柑橘产区的一个重要细菌病害，为国内外检疫对象。引起溃疡病产生的病原菌是柑橘黄单菌（xanthomonascitrisubsp.citri），在所有已经测序得柑橘黄单胞菌中都含有4个avr/ptha基因家族成员ptha1、ptha2、ptha3和ptha4，其中ptha4是病原菌的主要致病基因，该基因突变后病原菌在柑橘寄主上的致病力完全丧失。在病害发生过程中，病原菌首先克服寄主植物表层结构，随后依赖ptha4激活柑橘中的感病基因表达，使得溃疡症状最终形成。从提高寄主抗性角度对柑橘溃疡病进行控制，除了选用基础抗性较强的柑橘品种，对ptha4的致病功能进行干扰也是一个有效的控制策略，主要的突破途径在于干扰ptha4对感病基因的激活。目前并未有利用水稻白叶枯病菌的tale蛋白avrxa7用于防治柑橘溃疡病的报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供水稻白叶枯病菌的tale蛋白avrxa7在柑橘溃疡病生物防治中应用。本发明利用水稻白叶枯病菌的avrxa7干扰柑橘溃疡病菌的致病基因ptha4对柑橘感病基因的激活，从而达到防治柑橘溃疡病菌的目的。

本发明的优点在于：本发明的avrxa7基因来源于引起水稻白叶枯病菌的稻黄单胞（xanthomonasoryzaepv.oryzae）(yangb,zhuwg,johnsonlbandwhiteff.thevirulencefactoravrxa7ofxanthomonasoryzaepv.oryzaeisatypeiiisecretionpathway-dependentnuclear-localizeddouble-strandeddna-bindingprotein.pnas,2000,97:9807–9812.)，在基因序列上与柑橘溃疡病菌ptha4同源性很高，属同一个基因家族成员。在野生型柑橘溃疡病菌中异源表达avrxa7，溃疡菌丧失了在柑橘上形成溃疡症状的能力。转录组学和real-timepcr结果显示，与ptha4对应的感病基因在引入avrxa7以后，不能被诱导表达，表明avrxa7干扰了ptha4对柑橘感病基因的激活。将avrxa7在荧光假单胞菌中表达，对溃疡病有显著的防治作用。相对柑橘溃疡病菌而言，avrxa7虽然是来源于黄单胞属的不同种菌株，但可以干扰ptha4在致病过程中的功能，可用做高效生防菌株的分子改造，应用于柑橘溃疡病的生态物控制。

附图说明

图1、avrxa7在柑橘溃疡病菌中抑制溃疡病害的发生。

图2、表达avrxa7的荧光假单胞菌对柑橘溃疡的防治作用。

具体实施方式

实施例1

（1）在野生型柑橘溃疡病菌中表达avrxa7

将avrxa7基因克隆到质粒pufr034中，通过电转化方法进入野生型柑橘溃疡病菌xac29-1中。在nb液体培养基中培养后，注射接种柑橘叶片。5天后观察溃疡症状的形成情况。接种野生型菌株的区域，一般3天后就可以看到溃疡症状出现，5天后注射接种区域的溃疡斑隆起；而表达avrxa7的溃疡菌株接种后，观察不到溃疡症状的形成（图1）。

（2）avrxa7对柑橘溃疡病菌ptha4基因致病功能的干扰

柑橘植物接种携带avrxa7的柑橘溃疡菌株以后，运用转录组学方法分析寄主植物的基因表达情况，发现一批与avrxa7和ptha4相关的基因，其中最为突出的是与ptha4对应的感病基因。接种野生型菌株后，与ptha4对应的感病基因诱导表达，表达水平增高100多倍，而接种表达avrxa7的溃疡菌株后，感病基因没有诱导表达，表明avrxa7干扰了柑橘溃疡病菌ptha4基因的致病功能。

（3）avrxa7在柑橘溃疡病害生物防治中的应用

将avrxa7转到生防荧光假单胞菌pf中，借助假单胞菌的iii型分泌系统，将avrxa7分泌到寄主植物细胞。将野生型柑橘溃疡病菌和pf在液体培养基中培养后，采用摩擦接种的方法在柑橘叶片制造伤口，用携带avrxa7的假单胞菌液浸泡叶片30秒，然后放在室温下自然风干；2小时后，浸液接种柑橘溃疡病菌。以后每隔10天用携带avrxa7的假单胞菌液处理一次叶片。1个月后观察溃疡病的发生情况。用水处理作为对照，1个月后，叶片出现典型的溃疡症状，在伤口的位置都会形成隆起的溃疡病斑。生防假单胞菌的伤口也会出现溃疡斑，但症状轻微，稍有凸起。携带avrxa7的假单胞菌处理的叶片仅能看到叶片伤口的愈合，没有看到任何溃疡症状出现（图2）。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

技术特征：

技术总结
本发明提供TALE蛋白AvrXa7在防治柑橘溃疡病害上的应用，属生物技术领域，从稻黄单胞菌中分离的TALE蛋白AvrXa7通过干扰柑桔溃疡病菌pthA4对感病基因的激活，抑制溃疡病害的发生；在生防荧光假单胞菌Pf中表达AvrXa7，能够有效抑制溃疡症状的形成，AvrXa7是构建高效基因工程菌株的极佳基因资源，在柑橘溃疡病的生物防控中具有重要的应用价值。

技术研发人员：邹华松;孙东玲;卓涛;范晓静;户勋
受保护的技术使用者：福建农林大学
技术研发日：2017.05.09
技术公布日：2017.07.25