专利名称：检测十种主要柑桔病害病原的基因芯片的制作方法
技术领域：
本发明属于一种基因芯片，具体的说，涉及一种检测主要的十种柑桔病害病原的 基因芯片。
背景技术：
柑桔是世界第一大水果，我国柑桔栽培面积和产量均居世界首位，在国民经济中 占有十分重要的地位。近几年来，随着我国柑桔产业的发展和优势产业带的确立，柑桔的种 植区域更趋集中，面积亦进一步扩大，而病害问题日益引起生产者的重视。随着国际柑桔 贸易的持续增长及种质资源交换的日益频繁，各种检疫性柑桔病害传入我国的机率不断加 大。柑桔麻风病是由柑桔麻风病毒(Citrus leprosis virus, CiLV)引起的一类重要 柑桔病毒病害，于20世纪20年代首次在巴拉圭发现，主要由短须螨(Brevipalpus spp.) 传播。目前该病主要分布于巴西、阿根廷、巴拿马、委内瑞拉等南美洲国家，严重威胁到北美 和加勒比地区的柑桔产业，最近在美国佛罗里达州已检测到该病。柑桔鳞皮病是由一种多 分体单链RNA病毒一柑桔鳞皮病毒(Citrus psorosis virus, CPV)引起的病害，主要分布 于阿根廷、巴西、意大利、西班牙以及美国等国家，对柑桔产业造成十分严重的为害。柑桔杂 色褪绿病是由木质部难养菌(Xyllela fastidiosa)引起的一种细菌性病害，于1987年首 次在巴西的圣保罗和Minas Gerais地区发现，由带病苗木和叶蝉、沫蝉等昆虫介体传播。 迄今，该病已蔓延到巴西的各个柑桔产区和阿根廷、巴拉圭等南美国家。柠檬枝枯病(Mal secco)是由桔茎点霉(Phoma tracheiphila)引起的是一种检疫性真菌病害，主要分布在 地中海、黑海地区，对许多沿海周边国家的柑桔生产尤其是柠檬生产造成了一定的经济损 失。目前以上四种病害在我国尚未发生，但我国存在传播柑桔麻风病毒和木质部难养菌的 的虫媒，柑桔鳞片病毒和桔茎点霉亦在我国部分柑桔产区存在定殖扩展的生境，因此检疫 是杜绝该类病害在我国发生的重要手段。柑桔黄龙病和溃疡病是国内重要的检疫对象，柑 桔衰退病毒、柑桔碎叶病毒、柑桔裂皮病类病毒和温州蜜柑萎缩病毒亦是我国发生的主要 病毒类病害。迄今为止，由于高特异性和灵敏性，PCR和RT-PCR是检测以上柑桔病害最为高效 的方法，由于柑桔病害种类多，对每种病害进行检测较费时费力，不宜在我国出入境检验检 疫中推广应用。因此建立新的检验检疫技术手段已迫在眉睫。基因芯片是90年代中期以来发展极为迅速和活跃的技术。其原理是将大量DNA探 针片段有序的固化于支持物表面，然后与标记的生物样品中的DNA分子杂交，再对杂交信号 进行检测分析。基因芯片在核酸序列测定、基因图片检测、基因表达等领域中得到广泛应用。
发明内容
为解决以上技术问题，本发明的目的在于提供一种检测柑桔主要病害病原的基因芯片，达到快速、准确、高通量检测10种主要柑桔病害病原，以及它们的混合感染，可用于 口岸检验检疫。本发明目的是这样实现的
一种检测十种主要柑桔病害病原的基因芯片，包括固相载体和固定在该固相载体上的 特异性寡核苷酸探针，固相载体为光学级醛基基片，其关键在于固定在所述固相载体上的 特异性寡核苷酸探针具有SEQ ID NO 1- SEQ ID NO 10所示的寡核苷酸序列或者与SEQ ID NO 1- SEQ ID NO :10所示的寡核苷酸序列互补的DNA或RNA。上述固相载体上固定有阴性对照和作为荧光标记对照的SEQ ID N0:11所示的序 列。基因芯片的制备方法
1.设计病原特异性探针选择柑桔病原(病毒、细菌、真菌)保守序列基因为靶标序列， 及上述SEQ ID NO :1- SEQ ID NO: 11的特异性探针序列。从GenBank中公布的十种病原中选择保守基因的为靶序列，从中选取特异性探 针，并通过Blast比对验证。所述的探针见序列表所示。2.合成探针使用上海生物工程有限公司合成仪合成。3.探针处理5’端加T到40个碱基并在5’端氨基修饰，使它能够固化在醛基基 片上；
4.基因芯片的制备使用点样仪在基片上按预先设定好的顺序进行电样，将点好的基 片在紫外交联仪下进行交联，80°C干烤2小时备用。5、杂交及检测取杂交液9 μ 1和加Cy3标记PCR产物混合物9 μ 1，42°C恒温水浴 杂交2小时，洗片扫描观察结果。检测时
1)提取待检柑桔样品总核酸备用；
2)Cy3标记的PCR或RT-PCR扩增在PCR反应管中加入Cy3_dCTP，在扩增过程中渗 Λ Cy3-dCTP ；
3)杂交及检测取杂交液9μ 1和加Cy3标记PCR产物混合物9 μ 1，42°C恒温水浴杂交 2小时，洗片扫描观察结果(有无荧光反应)。表1为基因芯片上所有探针及其检测作用
权利要求
一种检测十种主要柑桔病害病原的基因芯片，包括固相载体和固定在该固相载体上的特异性寡核苷酸探针，其特征在于固定在所述固相载体上的特异性寡核苷酸探针具有SEQ ID NO1 SEQ ID NO10所示的寡核苷酸序列或者与SEQ ID NO1 SEQ ID NO10所示的寡核苷酸序列互补的DNA或RNA。
2.根据权利要求1所述检测十种主要柑桔病害病原的基因芯片，其特征在于所述固 相载体上固定有阴性对照和作为荧光标记对照的SEQ ID N0:11所示的序列。
全文摘要
本发明公开了一种检测十种主要柑桔病害病原的基因芯片，包括固相载体和固定在该固相载体上的特异性寡核苷酸探针，其特征在于固定在所述固相载体上的特异性寡核苷酸探针具有SEQIDNO1-SEQIDNO10所示的寡核苷酸序列或者与SEQIDNO1-SEQIDNO10所示的寡核苷酸序列互补的DNA或RNA。本发明方法设计合理，能够提高检测柑桔主要病害病原的敏感性、特异性及准确性；高通量，一次检测即能检出十种柑桔病害，十种病毒基本概括了柑桔主要病害病原；能够发现各种柑桔病原物的混合感染。
文档编号C12Q1/70GK101956023SQ20101028298
公开日2011年1月26日 申请日期2010年9月16日 优先权日2010年9月16日
发明者刘科宏, 刘金香, 周常勇, 周彦, 唐科志, 宋震, 李中安, 杨方云, 王雪峰 申请人:西南大学