专利名称：猪psma1基因中一个可用于溯源的snp分子标记及其检测方法
技术领域：
本发明属食品安全领域，具体涉及猪PSMAl基因中一个可用于溯源的SNP分子标记及其检测方法。
背景技术：
随着生活水平和保健意识的提高，人们越来越注重食品安全问题。猪肉制品作为人膳食中重要的蛋白质来源，如何确保其安全卫生，保障消费者的身体健康和生命安全已成为全球性的热点问题。世界各国政府纷纷采取一系列的技术措施来强化对肉产品的安全管理，以期最大程度上减少食品安全事件的发生。我国各大城市也纷纷建立了肉产品的追溯系统，通过肉制品的溯源管理，能够为消费者提供准确而详细的有关产品的信息，有利于生产经营者及时发现各环节中存在的不安全隐患，为消费者提供一个获取有效可靠信息的途径。更为重要的是，大大加强了政府部门对肉质品质量安全的监管，为国家迅速建立食品安全风险的应对机制提供有效信息，将有助于社会的安定。但是我国肉产品追溯系统所采用的标签技术存在标签丢失、记录出差、标记图案模糊不清以及标签容易人为改换等缺点；而国外发达国家所采用的DNA溯源技术是基于个体DNA指纹图谱的生物学技术，有着绝对的不可更改性和唯一性，不受人为因素影响。而且因为DNA溯源技术容易分型、重复性好、检测手段简单快捷、成本低廉等成为目前国际上被公认为最具发展潜力和应用价值的快速溯源技术。DNA溯源技术的产生源于DNA的遗传与变异，用于构建个体DNA指纹图谱的分子标记有AFLP标记(扩增片段长度多态性)、SSR标记(微卫星标记)和SNP标记(单核苷酸多态性)。AFLP具有的高度可靠性和操作简便性，但是AFLP存在着对模板反应表现迟钝、谱带可能发生错配与缺失、成本相对比较高等缺点。相比SNP标记，微卫星标记的等位基因众多，多态丰富，但也正因如此，使得SSR标记的带型复杂，给DNA指纹识别自动化和规模化带来困难。SNP标记是第三代分子遗传标记，是指基因组同一位点上单个核苷酸的变异，包括置换、颠换、缺失和插入，但实际上只发生转换和颠换，并且一般表现为二等位基因，非此即彼，非常适宜高通量自动化分析，所以日益成为动物身份识别最受关注的分子标记。但是用于肉产品溯源的SNP标记不同于一般的SNP标记，对于单个的SNP标记，它必须至少具有以下特征(1)变异度高，在品种或品系中等位基因频率接近；(2)品种间等位基因分布频率差异小；(3)杂合度大于等于0. 3。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种猪PSMAl基因中一个可用于溯源的SNP分子标记及其检测方法。本发明的SNP分子标记在商品猪培育中，可以广泛用于猪肉产品DNA 溯源及其检测，特别是用于猪肉产品的安全性溯源。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案所述的猪PSMAl基因中一个可用于溯源的SNP分子标记，是通过DNA池(pool)测序获得，并在包括9个猪品种或品系的试验群体(共计204个个体)中，分析该SNP分子标记在试验群体中等位基因的分布情况，发现该分子标记在不同的品种和品系中的等位基因频率接近，多态性丰富，品种或品系间等位基因频率分布差异小，初步判定该SNP标记可用作猪肉产品DNA溯源。所述的SNP分子标记，其序列如SEQ ID NO 3所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示。 所述的SNP分子标记的第30位碱基处有一个碱基突变30A — 30G。所述的SNP分子标记的第263位有一等位基因A或G，第27位有一等位基因G。所述的SNP分子标记位于猪PSMAl基因的DNA片段中。所述的猪PSMAl基因的DNA片段，其序列如SEQ ID NO 1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。该DNA片段的第30位碱基处有一个碱基突变30A — 30G。所述的猪PSMAl基因的DNA片段共1487bp，其包含部分第六外显子、第八外显子的序列，完整的第七外显子，第六内含子和第七内含子序列。分离所述的PSMAl基因的DNA片段的正、反向引物，其碱基序列如SEQID NO 5和 SEQ ID NO 6所示，形成一引物对。所述的SNP分子标记的检测方法，采用PCR-BfaI-RFLP法进行，具体包括以下步骤(1)构建猪的 DNA 池(pool)；(2)设计正、反引物分离猪PSMAl基因的DNA片段，测序并分析；(3)突变位点检测的正、反引物的重新设计及检测方法的建立；(4)采集猪的9个品种或品系的耳组织样，共计204个个体；(5)检测SNP标记在试验群体的分布，筛选适用于猪肉产品溯源的SNP标记。其中，上述检测方法中，突变位点检测的正、反向引物，其序列分别如SEQ ID NO 5 和SEQ ID NO 7所示，形成一引物对。本发明采用DNA池检测到猪PSMAl基因中存在的SNP分子标记，在包括9个猪品种或品系的试验群体中，分析该SNP分子标记在试验群体中等位基因的分布情况，发现该分子标记在不同的品种或品系中的等位基因频率接近，多态性丰富，品种或品系间等位基因频率分布差异小，并且杂合度都大于0. 3，初步判定该SNP标记可用作猪肉产品DNA溯源以及猪肉产品的安全性溯源中。
具体实施例方式以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案。实施例1分子标记的查找(I)DNA 池(pool)的构建分别随机采集杜洛克猪、梅山猪个体各2头(不分性别)的耳组织，提取DNA后， 等量吸取4个个体的DNA放入同一离心管中，混勻待用。
(2)引物设计以人类 PSMAl 基因的 cDNA 序列(NM_148976) (http//www. ncbi. nlm. nih. gov/) 为模板，设计引物分离猪PSMAl基因的DNA片段(以一头杜洛克猪的DNA为PCR扩增的模板)，引物如下正向引物5' -ctctgcctgtgtctcgtctt-3‘(参见序列 SEQ ID NO 5)反向引物5'-gtacgagctgattgagaacg-3‘(参见序列 SEQ ID NO 6)PCR反应总体积为20 μ 1，其中猪基因组DNA约lOOng，含1 Xbuffer (Promega公司)，1.5mm0l/L MgCl2, dNTP (上海生工生物公司)终浓度为150 μ mol/L，引物终浓度为 0. 2 μ mol/L, 2U Taq DNA 聚合酶(Promega 公司)。PCR 扩增程序为94°C 4min,然后循环 30 次 94°C 30s, 58°C退火 30s，72 V 40s,最后 72°C延伸 IOmin0PCR反应产物用1 %琼脂糖凝胶电泳检测。(3)克隆测序分析将得到的猪PSMAl基因PCR产物按照如下常规方法进行克隆。PCR产物的纯化在紫外灯下从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1. 5ml Ependorff管中，用PCR产物纯化试剂盒(天根生化科技有限公司)纯化。连接反应将纯化的PCR产物与pMDIS-T载体(大连宝生物公司)连接，连接反应总体积是10 μ 1，其中包括5 μ 1 solution I (大连宝生物公司)，0. 5 μ 1的T载体(大连宝生物公司)，2. 5 μ 1的纯化PCR产物，最后加入2 μ 1灭菌水置4°C水浴过夜。转化无菌状态下取100 120 μ 1感受态细胞(天根生化科技有限公司)于1. 5ml Ependorff管中，将5μ 1的连接产物加入混勻，在冰上放置30min，42°C热激90s，其间不要摇动Ependorff管，取出后冰浴3 ％iin，加入400 μ 1无抗生素的LB液体培养基，37°C平放Ih后倒置培养。菌落PCR鉴定经菌落PCR鉴定后的菌株在LB培养基37°C培养过夜，随即挑取多个克隆子送到上海生工生物有限公司测序。经测试，该经拼接后的猪PSMAl基因的DNA片段序列如SEQ ID No 1所示，共 1487bp，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No 2所示。经分析发现该DNA序列的第30碱基处存在一个碱基突变(30A — 30G)，通过分子生物学软件分析，发现该第30碱基处的碱基突变 ^ BfaI-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) ■生。(4)突变位点检测引物的重设计为了提高检测效率，以上述(3)中的测序结果为模板，重新设计了用于检测30A — 30G的反向引物，正向引物的序列如SEQ ID NO 5所示，反向引物-新 5' -gcaccttatttagaacccac-3‘(参见序列 SEQ ID NO 7)。PCR反应总体积为20 μ 1，其中猪基因组DNA约lOOng，含1 Xbuffer (Promega公司)，1. 5mmol/LMgCl2, dNTP 终浓度为 150 μ mol/L，引物终浓度为 0. 2 μ mol/L, 2U Taq DNA 聚合酶(Promega公司)。PCR 扩增程序为94°C 4min,然后循环 30 次 94°C 20s, 58°C退火 20s，72°C 20s,最后72°C延伸lOmin。PCR反应产物用1 %琼脂糖凝胶电泳检测，产物大小为^!3bp，即为本发明的SNP分子标记，其序列如SEQ ID NO 3所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示。经分析发现该SNP分子标记的突变位点位于第30位碱基，即30A — 30G。(5) RFLP检测方法的建立酶切反应总体积10 μ 1，其中IXbuffer 10 μ 1，PCR产物3 5 μ 1，限制性内切 BlBfaI为0.5μ 1(5扔，用H2O补足10 μ 1，37 °C水浴4h，称取0. 6g琼脂糖溶于15. 75ml DEPC(上海生工生物公司)处理水中，稍冷却(60°C )，加入5ml的5X甲醛凝胶电泳缓冲液和4. 25ml的37%甲醛溶液，混勻制胶，电泳后检测酶切结果。结果发现本发明的SNP分子标记序列中，A等位基因只有—个片段，G等位基因有27bp和236bp两个片段，这两个等位基因可组成三种基因型AA，AG, GG。实施例2等位基因的分布情况(1)试验群体的设计试验组采集二花脸猪(23头)、梅山猪(33头)、上海白猪(11)、沙乌头猪(30 头)、大白猪( 头)、长白猪(15头)、皮特兰(15头)、杜洛克(15头)和培养品种申农 (34)个体的耳组织，提取DNA，共计204个DNA样本。试验群体的目的在于检测SNP分子标记在不同品种中的分布情况。(2)基因型检测禾U用正向引物5' -ctctgcctgtgtctcgtctt-3‘(参看 SEQ ID NO 5)反向引物-新5' -gcaccttatttagaacccac-3‘(参看 SEQ ID NO 7)进行扩增，用相同的RFLP方法检测试验群体所有的个体基因型。(3)统计分析记录所有个体的基因型，并计算等位基因频率和杂合度，结果如下表1所示。表 权利要求
1.猪PSMAl基因的DNA片段，其序列如SEQID NO 1所示，其第30位碱基处有一个碱基突变30A — 30G。
2.根据权利要求1所述的猪PSMAl基因的DNA片段，其编码的氨基酸序列如SEQID NO 2所示。
3.根据权利要求1所述的猪PSMAl基因的DNA片段，其特征在于，所DNA片段共 1487bp，其包含部分第六外显子、第八外显子的序列，完整的第七外显子，第六内含子和第七内含子序列。
4.分离权利要求1至3任一项所述的PSMAl基因的DNA片段的正、反向引物，其碱基序列如 SEQ ID NO 5 和 SEQ ID NO 6 所示。
5.一种SNP分子标记，位于权利要求1至3任一项所述的猪PSMAl基因的DNA片段中， 其序列如SEQ ID NO 3所示。
6.根据权利要求5所述的SNP分子标记，其编码的氨基酸序列如SEQIDNO 4所示。
7.根据权利要求5所述的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记的第30位碱基处有一个碱基突变30A — 30G。
8.根据权利要求5所述的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记的第263位有一等位基因A或G。
9.根据权利要求5所述的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记的第27位有一等位基因G。
10.权利要求5所述的SNP分子标记的检测方法，其特征在于，采用PCR-BfaI-RFLP方法进行，具体包括以下步骤(1)构建猪的DNA池；(2)设计正、反引物分离猪PSMAl基因的DNA片段，测序并分析；(3)突变位点检测的正、反引物的重新设计及检测方法的建立；(4)采集猪的9个品种或品系的耳组织样，共计204个个体；(5)检测SNP标记在试验群体的分布，筛选适用于猪肉产品溯源的SNP标记。
11.根据权利要求10所述的检测方法，其特征在于，突变位点检测的正、反向引物的序列分别如SEQ ID NO 5和SEQ ID NO 7所示。
12.权利要求5所述的SNP分子标记用于猪肉产品的DNA溯源。
全文摘要
本发明涉及一种猪PSMA1基因中一个可用于溯源的SNP分子标记及其检测方法。所述的SNP分子标记是通过DNA池(pool)测序获得，其序列如SEQ ID NO 3所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示。所述的SNP分子标记位于序列如SEQ ID NO 1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示是猪PSMA1基因的DNA片段中。在包括9个猪品种/品系的试验群体中，分析本发明的SNP分子标记在试验群体中等位基因的分布情况，发现该分子标记在不同的品种或品系中的等位基因频率接近，多态性丰富，品种或品系间等位基因频率分布差异小，并且杂合度都大于0.3，由此初步判定本发明的SNP分子标记可用作猪肉产品的DNA溯源。
文档编号C12N15/11GK102399775SQ20101028291
公开日2012年4月4日 申请日期2010年9月16日 优先权日2010年9月16日
发明者吴潇, 唐雪明, 张小波, 朱宏, 王金斌, 蒋玲曦, 谭芙蓉, 赵凯, 陶世如 申请人:上海市农业科学院