本发明涉及一种日本扁柏初代培养方法，属于树木无性繁殖技术领域。
背景技术：
日本扁柏(chamaecyparisobtusa)为柏科扁柏属植物，主要种植区分布在日本，台湾分布的扁柏为变种，由人工引种栽培。
日本扁柏是一种叶端金黄、四季观赏的植物，用有性繁殖进行播种，会使品种的特征退化，而扦插繁殖虽然能够进行，但繁殖系数仍很低。一旦日本扁柏的组培技术获得重大突破，则可进行大规模育苗，一方面可以作为商业生产手段，另一方面也能成为保护珍稀物种的重要生物技术。目前国内针对日本扁柏的组织培养技术还没有进行相应研究，因此一种针对日本扁柏组织培养技术的研究很有意义，有助于日本扁柏能在园林绿化中尽快大面积广泛应用。
技术实现要素：
发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供一种日本扁柏初代培养方法，该方法通过利用不同种类并含有不同浓度生长激素的初代培养基对日本扁柏外植体进行组织培养，最终得到日本扁柏外植体的最优培养基类型以及最佳激素浓度。
发明内容：为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：
一种日本扁柏初代培养方法，包括如下步骤：
步骤1，选取一株健康生长的植株作为母本，从母本植株上剪下当年生的茎尖；
步骤2，将步骤1得到的茎段分别进行洗涤、消毒处理，再用浓度为1～1.5g/l的升汞浸泡3～5min，浸泡后冲洗干净；
步骤3，剪去与升汞接触过的创面，将外植体分别接种到不同种类的初代培养基中；
步骤4，初代培养中，培养室的培养温度为23～27℃，光照强度为1600～1700lx，光照波长为350～750nm，光照时数为16～18h/d；
步骤5，观察不同种类初代培养基搭配不同浓度生长激素对外植体分枝数和生长量的影响，从而得到最优培养基类型以及最佳激素浓度。
其中，步骤1中，所述茎尖为成熟日本扁柏一年生茎尖，利用植物的嫩茎进行组培，可避免伤害植株。
其中，步骤2的具体操作方式为：先用一定浓度的肥皂水对步骤1的茎尖进行洗涤，洗涤干净后再用流动自来水冲洗4h以上；接着在超净工作台上用浓度为75～80％的酒精消毒30～40s，消毒后用无菌水反复冲洗3遍；最后用浓度为1～1.5g/l的升汞浸泡3～5min，浸泡后用无菌水冲洗3遍。在用升汞以及酒精对茎段进行消毒时，消毒时间在一定程度上影响了外植体的成活率。
其中，步骤3中，初代培养基的种类有1/2ms培养基、ms培养基和wpm培养基，优选wpm培养基。
其中，初代培养基中含有的生长激素为6-ba和naa。
其中，初代培养基中生长激素6-ba的浓度为0～1mg/l，优选0.5mg/l，初代培养基中生长激素naa的浓度为0.05～0.45mg/l，优选0.05mg/l。
其中，本发明组织培养方法还需要将日本扁柏组培苗独立放置或远离其他物种的组培苗，降低其真菌感染的几率。
相比于现有技术，本发明技术方案具有的有益效果为：
本发明组织培养方法通过利用不同种类并含有不同浓度生长激素的初代培养基对日本扁柏外植体进行组织培养，最终得到日本扁柏外植体的最优培养基类型以及最佳激素浓度；另外，本发明组织培养方法能够解决日本扁柏组织培养中生长速度慢、不易形成愈伤组织的问题；本发明组织培养方法可以大规模繁殖日本扁柏，以供给市场，有助于日本扁柏能在园林绿化中尽快大面积广泛应用。
附图说明
图1为不同种类培养基对外植体分枝数和生长量的影响。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
1实验材料与方法
1.1材料的选择
选择具有最大分化潜能的外植体是确保组织培养成功的关键。本实施例选用采自江苏省句容市郊外试验地的成熟日本扁柏一年生茎尖。
1.2方法
1.2.1材料处理
从健康生长的母本植株上剪去当年生的叶片茎尖，先用一定浓度的肥皂水对茎尖进行洗涤，洗涤干净后再用流动自来水冲洗4h以上；接着在超净工作台上用浓度为75％的酒精消毒30s，消毒后用无菌水反复冲洗3遍；最后用浓度为1g/l的升汞浸泡3min，浸泡后用无菌水冲洗3遍。将冲洗干净的茎段放于无菌纸上，并剪去与升汞接触过的创面，最后将外植体分别接种到不同种类的初代培养基中。外植体的基因型及年龄、不定芽发育情况、激素的使用、预处理、培养环境(温度、光照)等都会影响外植体生长发育质量。
1.2.2环境的选择
培养室的温度、湿度、光照时数、光质等都会在一定程度上影响外植体的器官分化和生长。初代培养中，培养室的培养温度为(25±2)℃左右，光照强度为1600lx，光照波长为350～750nm，光照时数为16h/d；不同植物的培养环境应根据具体情况调整。
1.2.3实验设计
本实施例选用的培养基分别为1/2ms培养基、ms培养基和wpm培养基，生长激素分别为6-ba和naa；采用三种培养基附加不同浓度的激素，得到9种不同的试验组，每个试验组有20瓶相同试验条件的试验瓶，每个试验瓶中接种有经过相同处理的外植体，总计重复实验3次。表1为实验设计表。
表1为9组试验组对应的培养基以及激素配比表
2结果与分析
2.1不同种类的培养基对外植体发枝数及生长量的影响
通过对不同培养基诱导的不定芽产生的分枝数以及生长量的总数进行对比，由图1可以明显看出wpm培养基优势明显，其产生的分枝数和生长量明显高于其他两个培养基的水平，而ms培养基明显低于其他两个培养基的水平，1/2ms的生长情况略低于wpm的水平；由此可得，wpm培养基为最优培养基。
2.2不同激素及其浓度对发枝数和生长量的影响
各种培养基中加入naa，6-ba为两个变量，根据两种激素各有的三种浓度确立9种不同的实验组合，对9个观测值进行方差分析。
表2两种激素浓度对外植体发枝数的方差分析
表3为生长激素6-ba浓度对外植体分叉数影响的多重比较
表4为生长激素naa浓度对外植体分叉数影响的多重比较
对生长激素6-ba和naa在不同浓度下对日本扁柏的分枝数数据进行方差分析(见表2、表3、表4)，结果表明，6-ba不同浓度下分叉数水平不明显，差异不显著，表明当6-ba浓度为0、0.5、1mg/l时，对日本扁柏的发枝数并无显著影响；而naa的三种浓度下分枝数水平差异极显著，浓度为0.05mg/l下差异最不明显，而浓度分别为0.15以及0.45mg/l下均有很大差异。
对生长激素为6-ba和naa在不同浓度下对日本扁柏的生长量数据进行方差分析(见表5、表6、表7)，结果表明，naa不同浓度下生长量水平无明显差异，而6-ba对应的三种浓度下，当6-ba浓度为0.5mg/l时生长量差异最为显著。其他两个浓度无明显差异。通过对6-ba和naa影响的分叉数及生长量结果进行ssr检测和比较后发现，当6-ba浓度为0.5mg/l时的生长量优势明显，而当naa为0.15mg/l时的发枝数优势最为显著。
表5为9种试验组处理下方差分析
表6为6-ba各浓度对外植体生长量的影响
表7为naa各浓度对外植体生长量的影响
2.3不同培养基和不同浓度激素下的愈伤组织形成状况
表8各试验组处理后愈伤组织发生情况
注：+++为愈伤组织生长旺盛，++为愈伤组织生长一般，+为愈伤组织生长较弱
由表8可以直观得出，在培养基为1/2ms+0.5mg/l(6-ba)+0.15mg/l(naa)下的愈伤组织形成状况和在培养基为wpm+0.5mg/l(6ba)+0.05mg/l(naa)下的愈伤组织形成状况大致相同，均为旺盛。根据之前分析的培养基及激素浓度对分枝数和生长量的影响，综合得出wpm+0.5mg/l(6ba)+0.05mg/l(naa)为日本扁柏外植体组织培养的最佳选择。
虽然上述实施例结果表明1/2ms、ms、wpm培养基都能诱导芽分化和形成愈伤组织，这说明低盐浓度的培养基有利于日本扁柏的分化，而植物激素的添加对植物的生长具有调控作用，但过量的激素反而会阻碍植株的生长；但wpm培养基对不定芽的分枝和生长效果最好，且不定芽生长非常旺盛，颜色嫩绿，尤其是顶端呈现新绿色，有效芽多。这可能和wpm培养基中无机盐含量和有机物含量有关，其含量尤其适合日本扁柏生长；加上培养基中所含的蔗糖和激素，加速促进了愈伤组织的形成和芽的分化；而在ms培养基和1/2ms培养基中生长的芽活性较低，顶端芽呈现褐色甚至枯萎的情况，这可能是由于二者培养基中铁盐含量降低并影响了叶绿素的形成。
对日本扁柏进行组织培养不仅可以快速繁殖，而且可以保留其遗传性状(保证它母本的优良性状)，有利于遗传和改良它的品种特性，保证其物种的稳定性，使新品种得到有效保存。