一种黄芪种苗的培养方法与流程

本发明属于中药材育苗领域，具体的说是涉及一种黄芪种苗的培养方法，尤其是一种利用间歇浸没式生物反应器培养黄芪种苗的方法。

背景技术：

黄芪［astragalusmembranaceusbge.var.mongholicus(bge.)hsiao］为豆科黄芪属多年生草本植物，根部可入药，具有补气固表、利尿、脱毒排脓、强心降压、降血糖、增强机体免疫力等功效。随着黄芪保健药品等日益畅销，黄芪的需求量越来越大，由于长期过渡采挖，野生资源几近枯竭，而黄芪种子有硬实现象，出芽率低，人工种子繁殖也受到影响。因此，黄芪进行组织培养和植株再生的研究在种苗的生产上具有重要的意义。我国对黄芪的组织培养的研究早在20世纪80年代已经开始，到90年代已经成熟，也已应用到黄芪种苗的生产上，但至今仍使用是传统的固体培养方式，该培养方式劳动力投入高、物耗大、组培苗对外界环境适应能力差，导致黄芪种苗的生产成本高。

本发明采用间歇浸没培养的方式进行黄芪种苗的培养，设备通量大效率高，采用液体培养物耗少，自动化程度高劳动力投入低，减少转接次数污染率低，培养过程内外气体主动交换组培苗更健康，与传统的固体相比大大的降低了生产成本。目前，还没有利用间歇浸没生物反应器培养黄芪种苗的报道及相关专利，本发明将公开一种黄芪种苗生产的新技术。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明提供了一种黄芪种苗的培育方法，该方法周期短、成本低、种苗质量高。

为了达到上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明是一种黄芪种苗的培养方法，所述培养方法包括外植体的准备、增殖培养和生根培养，所述培养方法为利用间歇浸没式生物反应器进行培养。

本发明的进一步改进在于：所述培养方法包括如下步骤：

（1）外植体的准备：将黄芪组培苗在无菌操作台中，切成黄芪茎段，接种到装有1l液体培养基三角瓶中，密封包扎后放到培养室中培养3~5天；

（2）增殖培养：将步骤（1）中的准备的外植体连同液体培养基倒入间歇浸没式生物反应器的罐体中，将所述罐体连接到反应器系统中，设定反应器的间歇浸没频率，在培养室中培养15~20天；

（3）生根培养：在无菌条件下将增殖培养完成的生物反应器罐体中的液体培养基倒出，倒入1l促进黄芪组培苗生根的液体培养基，将上述换液完成的反应器罐体连接到反应器系统中，设定反应器间歇浸没频率，在培养室中培养20~30天。

本发明的进一步改进在于：在所述步骤（1）中的黄芪组培苗为利用固体培养方式培养获得的黄芪组培苗，所述固体培养的培养基配方为：ms+iba0.05~0.07mg/l+6-ba0.3~0.6mg/l+蔗糖30g/lph5.8~6.0，培养时间为10~15天。

本发明的进一步改进在于：在所述步骤（1）中，所述黄芪茎段为含有1~3个叶芽黄芪组培苗茎段，所述液体培养基配方为：ms+iba0.05~0.07mg/l+6-ba0.3~0.6mg/l+蔗糖30g/lph5.8~6.0，所述三角瓶连同液体培养基一起进行高温高压湿热灭菌冷却后备用，接种到三角瓶中黄芪茎段的数量50~200个，优选100~150个。

本发明的进一步改进在于：在所述步骤（2）中反应器间歇浸没频率为：浸没时间1~10min，优选5~8min，间隔时间2~12h，优选4~6h。

本发明的进一步改进在于：在所述步骤（3）中促进黄芪组培苗生根的液体培养基配方为：1/2ms+naa0.1~0.3mg/l+iba0.3~0.5mg/l+ac0.1~0.3g/l+蔗糖40g/lph5.8~6.0。

本发明的进一步改进在于：在所述步骤（3）中的换液方法是：在无菌工作台中，打开反应器罐体的盖子，将旧的液体培养基倒出，将新的促进黄芪组培苗生根的液体培养基倒入反应器罐体中，再将反应器罐体密封，所述新的液体培养基盛放于三角瓶中，并经过高温高压湿热灭菌后冷却。

本发明的进一步改进在于：在所述步骤（3）中反应器间歇浸没频率为：浸没时间1~8min，优选2~5min，间隔时间4~16h，优选6~8h。

本发明的进一步改进在于：所述培养室中的环境为光照强度：1800~2000lux，光照周期：14h/d，温度：22±1℃。

本发明采用的间歇浸没式生物反应器为自主制作的专利号为zl201020288879.1的间歇浸没的开合式植物生物反应器。

本发明的有益效果是：

（1）培养周期缩短：由于采用的是液体培养方式，植株更容易吸收营养而促进生长，而且在更换液体培养基的过程中无需移动植株，对植物没有造成伤害，对新培养基适应期短，因此与固体培养相比培养周期短；

（2）种苗质量高：在间歇浸没的培养过程中，反应器罐体中的气体与外界空气能够主动的进行有效的交换，使得罐体中的有害气体减少，二氧化碳和氧气充足，组培苗的光合作用强和呼吸作用正常，生产的种苗与固体培养相比更加健康、质量高；

（3）劳动力投入少，生产成本低：本发明的技术方案，只需要一次接种即可完成整个培养周期，无需固体培养的连续继代培养、不断转接，因此人工投入少，种苗的生产成本相比固体培养较低。

附图说明

图1是本发明黄芪组培苗在反应器增殖培养7天生长情况图。

图2是本发明黄芪组培苗在反应器生根培养20天生长情况图。

具体实施方式

为了加深对本发明的理解，下面将结合附图和实施例对本发明做进一步详细描述，该实施例仅用于解释本发明，并不对本发明的保护范围构成限定。

如图1-2所示，本发明是一种黄芪种苗的培养方法，所述培养方法包括外植体的准备、增殖培养和生根培养，所述培养方法为利用间歇浸没式生物反应器进行培养，所述培养室中的环境为光照强度：1800~2000lux，光照周期：14h/d，温度：22±1℃。

所述培养方法包括如下步骤：

（1）外植体的准备：将黄芪组培苗在无菌操作台中，切成黄芪茎段，接种到装有1l液体培养基三角瓶中，密封包扎后放到培养室中培养3~5天；

在所述步骤（1）中的黄芪组培苗为利用固体培养方式培养获得的黄芪组培苗，所述固体培养的培养基配方为：ms+iba0.05~0.07mg/l+6-ba0.3~0.6mg/l+蔗糖30g/lph5.8~6.0，培养时间为10~15天，在所述步骤（1）中，所述黄芪茎段为含有1~3个叶芽黄芪组培苗茎段，所述液体培养基配方为：ms+iba0.05~0.07mg/l+6-ba0.3~0.6mg/l+蔗糖30g/lph5.8~6.0，所述三角瓶连同液体培养基一起进行高温高压湿热灭菌冷却后备用，接种到三角瓶中黄芪茎段的数量50~200个，优选100~150个；

（2）增殖培养：将步骤（1）中的准备的外植体连同液体培养基倒入间歇浸没式生物反应器的罐体中，将所述罐体连接到反应器系统中，设定反应器的间歇浸没频率，在培养室中培养15~20天；在所述步骤（2）中反应器间歇浸没频率为：浸没时间1~10min，优选5~8min，间隔时间2~12h，优选4~6h；

（3）生根培养：在无菌条件下将增殖培养完成的生物反应器罐体中的液体培养基倒出，倒入1l促进黄芪组培苗生根的液体培养基，将上述换液完成的反应器罐体连接到反应器系统中，设定反应器间歇浸没频率，在培养室中培养20~30天，在所述步骤（3）中促进黄芪组培苗生根的液体培养基配方为：1/2ms+naa0.1~0.3mg/l+iba0.3~0.5mg/l+ac0.1~0.3g/l+蔗糖40g/lph5.8~6.0，在所述步骤（3）中的换液方法是：在无菌工作台中，打开反应器罐体的盖子，将旧的液体培养基倒出，将新的促进黄芪组培苗生根的液体培养基倒入反应器罐体中，再将反应器罐体密封，所述新的液体培养基盛放于三角瓶中，并经过高温高压湿热灭菌后冷却，在所述步骤（3）中反应器间歇浸没频率为：浸没时间1~8min，优选2~5min，间隔时间4~16h，优选6~8h。

实施例一

本发明是一种黄芪种苗的培育方法，该方法包括如下步骤：

（1）外植体准备：在无菌操作台中，将固体培养的黄芪组培苗切成含有2~3个叶芽的茎段，将100个黄芪茎段接种于已灭菌冷却后的含有1l液体培养基的三角瓶中，培养基的配方为：ms+iba0.05mg/l+6-ba0.5mg/l+蔗糖30g/lph5.8~6.0，接种完成后将三角瓶放到培养室中培养3天；

（2）增殖培养：在无菌操作台中，将步骤（1）中的准备好的外植体连同液体培养基一起倒入已灭菌冷却后的反应器罐体中，将罐体连接到反应器系统中，设定浸没频率为5min/4h，培养室中培养15天；

（3）生根培养：在无菌操作台中，将步骤（2）中培养了15天的反应器罐体的液体培养基倒出，并倒入1l已经灭菌完成并冷却了的促进黄芪组培苗生根壮苗的液体培养基，培养基配方为1/2ms+naa0.1mg/l+iba0.3mg/l+ac0.1g/l+蔗糖40g/lph5.8~6.0，将罐体再连接到反应器系统中，设定浸没频率为2min/6h，培养室中培养20天；

（4）培养室的环境设定为：光照强度：1800~2000lux，光照周期：14h/d，温度：22±1℃。

实施例二

本发明是一种黄芪种苗的培育方法，该方法包括如下步骤：

（1）外植体准备：在无菌操作台中，将固体培养的黄芪组培苗切成含有2~3个叶芽的茎段，将150个黄芪茎段接种于已灭菌冷却后的含有1l液体培养基的三角瓶中，培养基的配方为：ms+iba0.07mg/l+6-ba0.3mg/l+蔗糖30g/lph5.8~6.0，接种完成后将三角瓶放到培养室中培养5天；

（2）增殖培养：在无菌操作台中，将步骤（1）中的准备好的外植体连同液体培养基一起倒入已灭菌冷却后的反应器罐体中，将罐体连接到反应器系统中，设定浸没频率为8min/6h，培养室中培养20天；

（3）生根培养：在无菌操作台中，将步骤（2）中培养了20天的反应器罐体的液体培养基倒出，并倒入1l已经灭菌完成并冷却了的促进黄芪组培苗生根壮苗的液体培养基，培养基配方为1/2ms+naa0.3mg/l+iba0.5mg/l+ac0.3g/l+蔗糖40g/lph5.8~6.0将罐体再连接到反应器系统中，设定浸没频率为5min/8h，培养室中培养30天；

（4）培养室的环境设定为：光照强度：1800~2000lux，光照周期：14h/d，温度：22±1℃。

实施例三

本发明是一种黄芪种苗的培育方法，该方法包括如下步骤：

（1）外植体准备：在无菌操作台中，将固体培养的黄芪组培苗切成含有2~3个叶芽的茎段，将120个黄芪茎段接种于已灭菌冷却后的含有1l液体培养基的三角瓶中，培养基的配方为：ms+iba0.06mg/l+6-ba0.6mg/l+蔗糖30g/lph5.8~6.0，接种完成后将三角瓶放到培养室中培养4天；

（2）增殖培养：在无菌操作台中，将步骤（1）中的准备好的外植体连同液体培养基一起倒入已灭菌冷却后的反应器罐体中，将罐体连接到反应器系统中，设定浸没频率为6min/5h，培养室中培养18天；

（3）生根培养：在无菌操作台中，将步骤（2）中培养了18天的反应器罐体的液体培养基倒出，并倒入1l已经灭菌完成并冷却了的促进黄芪组培苗生根壮苗的液体培养基，培养基配方为1/2ms+naa0.2mg/l+iba0.4mg/l+ac0.2g/l+蔗糖40g/lph5.8~6.0将罐体再连接到反应器系统中，设定浸没频率为3min/7h，培养室中培养25天；

（4）培养室的环境设定为：光照强度：1800~2000lux，光照周期：14h/d，温度：22±1℃。

本发明中所采用的设备是自主制作的生物反应器设备。