一种提高赖草愈伤组织发芽率和存活率的培养基及培养方法与流程

本发明涉及一种提高赖草愈伤组织发芽率和存活率的培养基及培养方法，属于植物栽培技术领域。

背景技术：

植物组培技术是目前最常用的生物技术手段之一，发展至今已有100多年的历史，随着组织培养技术的发展，其在多种植物组织培养快速繁殖方面取得了很大的进展,组培方法也日趋成熟，在组织培养方面也形成了一套通用的方法，但这些方法只适用于一大类生物特性相似的植物，对于一些特殊的材料，同样的方法，其效果很差甚至不适用。

赖草是在我国分布最广的物种之一，具有广泛的生境适应性和逆境抵御能力，常被用于湿地周边植被建设，对改良盐碱化草地，防风固沙，人工植被恢复具有重要意义，同时也是一种具有较高经济价值的牧草。赖草生理特征是春季萌发早，一般在3月底到4月初返青，5月下旬抽穗，6～7月开花，7～8月种子成熟。其生长形态随环境而变化较大。在干旱或盐渍较重的生境，生长低矮，有时仅有3～4片基生叶，而生长在水分条件较好，盐渍化程度较轻的生境时(河谷冲积平原荒地或水渠边沿)，能生长成繁茂的株丛，并以强壮的根茎迅速繁衍，成为独立的优势群落。叶层可高达30～40厘米，能正常抽穗、开花，但结实率差，许多小花不孕，故采种较困难。

由于赖草是多年生禾本科植物，结实率很低，以克隆生殖为主，采用传统的改良栽培方法，不仅周期长，而且得到目标性状的几率很低。所以采用建立愈伤组织及转基因的方法开展特殊性状研究，可以极大缩短育种周期，(定向的应保留)培育赖草特殊表型。

葛荣朝(2005，2007)分别对多枝赖草组织培养条件进行了研究，其培养基组成和培养方法包括：(1)培养基组成：诱导培养基为ms+3mg/l2,4-d+0.5mg/l激动素+3％蔗糖+0.5％琼脂，继代培养基为ms+1mg/l2,4-d+0.5mg/l激动素+3％蔗糖+0.5％琼脂，分化培养基为1/2ms+0.5mg/l6-ba+0.5mg/liba+3％蔗糖+0.5％琼脂；(2)培养方法：选取籽粒饱满的草籽反复清洗,室温浸泡24h,然后于超净台上700ml/l的乙醇消毒30s,无菌水冲洗3次,再用含2ml/ltween20的有效氯为20ml/l的naclo溶液浸泡20min,之后用无菌水冲洗3次。将消毒的种子接种于诱导培养基上,25℃暗培养。生长状态良好的愈伤组织接种到分化培养基后,每天16h光照培养就可以诱导分化出完整植株。

中国专利文献cn102106255a(申请号201010606854.6)公开了小麦与多枝赖草属间杂交花培创造易位系新种质的方法，包括：(1)从小麦与多枝赖草杂交后代中选择基础材料，(2)基础材料与“桥梁品种”杂交后代的花药培养，(3)花培植株的炼苗移栽，(4)自然加倍植株的温室加代及单倍体植株的人工加倍，(5)收获花培植株后代纯系种子，经种植、鉴定得到易位系。本发明以“石4185”、“冀麦38”为母本作为“桥梁品种”与基础材料杂交，通过优选培养基及培养条件，使其愈伤组织出愈率最高达45.4％、分化率92.7％、其中绿苗分化率40％、最终绿苗得率26.3％、移栽成活率94％。

虽然多枝赖草和赖草同属禾本科，但是由于生物材料的差异，上述方法并不适用于赖草愈伤组织诱导。

技术实现要素：

本发明针对现有技术的补足，提供一种提高赖草愈伤组织发芽率和存活率的培养基及培养方法。本发明所述的培养方法可以明显提高赖草愈伤组织的诱导率和存活率，同时在继代培养的过程中使愈伤组织一直保持分化的状态。

本发明技术方案如下：

一种赖草愈伤组织扩繁培养基，在ms基础培养基基础上加入如下组分：

25～35g/l蔗糖，2.0～3.0mg/l2，4-二氯苯氧乙酸、0.4～0.6mg/l6-苄氨基腺嘌呤，8～12g/l琼脂，ph5.7～5.9。

根据本发明优选的，所述赖草愈伤组织扩繁培养基，在ms培养基基础上加入如下组分：

30g/l蔗糖，2.0～3.0mg/l2，4-二氯苯氧乙酸、0.4～0.6mg/l6-苄氨基腺嘌呤，10/l琼脂，ph5.8。

根据本发明优选的，所述2，4-二氯苯氧乙酸的浓度为2.0mg/l、2.2mg/l、2.4mg/l、2.6mg/l、2.8mg/l、3.0mg/l。

根据本发明优选的，所述6-苄氨基腺嘌呤的浓度为0.4mg/l、0.45mg/l、0.5mg/l、0.55mg/l、0.6mg/l。

上述ms基础培养基为本领域常规培养基，具体组分如下：

kno31.9g/l，nh4no31.65g/l，mgso4·7h2o0.37g/l，kh2po40.17g/l，cacl2·2h2o0.44g/l，mnso4·4h2o22.3mg/l，znso4·7h2o8.6mg/l，h3bo36.2mg/l，ki0.83mg/l，cuso4·5h2o40.025mg/l,cocl2·6h2o0.025mg/l，na2-edta37.3mg/l，feso4·4h2o27.8mg/l，na2moo4·7h2o0.25mg/l，甘氨酸2mg/l，盐酸吡哆醇0.5mg/l，盐酸硫铵素0.1mg/l，烟酸0.5mg/l，肌酸100mg/l。

上述赖草愈伤组织扩繁培养基在赖草愈伤组织扩繁中的应用。

一种赖草愈伤组织扩繁的培养方法，步骤如下：

(1)将赖草种子去除颖片后，水浸泡20～28小时，消毒后，接种于赖草愈伤组织扩繁培养基上，暗室诱导培养28～32d，挑取生长至0.45～0.55cm×0.45～0.55cm大小的愈伤组织；

(2)剥离步骤(1)挑取的赖草种胚诱导的愈伤组织，接种到赖草愈伤组织扩繁培养基上，暗培养38～42d，制得扩繁后的愈伤组织块；

(3)将步骤(2)制得的扩繁后的愈伤组织块接种至分化培养基，在25℃、16小时光照/天条件下培养28～32d，获得赖草幼苗。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中，水浸泡为采用流水浸泡。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中，消毒为在无菌环境下用体积百分比70％酒精消毒20s，无菌水清洗，然后用有效氯质量浓度为2％次氯酸钠溶液消毒20min，无菌水清洗。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中，暗室诱导培养条件为：在25℃条件下暗培养12小时，然后在23℃条件下暗培养12小时，依次循环变更温度培养条件。25℃12h/23℃12h暗室培养，在这样温度条件下培养比单一的25℃暗室培养的生长状态好。

根据本发明优选的，所述步骤(3)中的分化培养基，在ms基础培养基基础上加入如下组分：

30g/l蔗糖、10g/l琼脂、0.5mg/l吲哚丁酸(iba)、0.5mg/l6-苄氨基腺嘌呤(6-ba)。

上述分化培养基也可采用本领域常用的分化培养基。

有益效果

1、本发明在现有常规ms培养基的基础上，通过添加蔗糖、2，4-二氯苯氧乙酸和6-苄氨基腺嘌呤成分，获得了适用于赖草愈伤组织扩繁的培养基，该培养基可显著提高赖草愈伤组织发芽率和存活率，解决了现有赖草组织培养扩繁的技术难题；

2、本发明首次公开了赖草愈伤组织培养扩繁的过程中通过有规律的温度变化进行暗培养可以提高赖草愈伤组织发芽率和存活率，为赖草愈伤组织培养扩繁成功率的提高奠定了基础。

附图说明

图1为实施例4采用实施例1培养的扩繁后的愈伤组织块的照片；

图2-1为实施例4采用实施例1培养30天后的赖草幼苗的照片；

图2-2为实施例4采用实施例1培养50天后的赖草幼苗的照片；

图3为实施例4采用对比例1培养的扩繁后的愈伤组织块的照片；

图4-1为实施例4采用对比例2培养的扩繁后的愈伤组织块的照片；

图4-2为实施例4采用对比例2培养的扩繁后的愈伤组织块的照片；

图5为实施例4采用对比例3培养的扩繁后的愈伤组织块的照片；

图6-1为对比例4培养30天后的愈伤组织的照片；

图6-2为实施例4采用实施例1培养30天后的愈伤组织的照片；

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。

实施例中所述ms基础培养基，具体组分如下：

kno31.9g/l，nh4no31.65g/l，mgso4·7h2o0.37g/l，kh2po40.17g/l，cacl2·2h2o0.44g/l，mnso4·4h2o22.3mg/l，znso4·7h2o8.6mg/l，h3bo36.2mg/l，ki0.83mg/l，cuso4·5h2o40.025mg/l,cocl2·6h2o0.025mg/l，na2-edta37.3mg/l，feso4·4h2o27.8mg/l，na2moo4·7h2o0.25mg/l，甘氨酸2mg/l，盐酸吡哆醇0.5mg/l，盐酸硫铵素0.1mg/l，烟酸0.5mg/l，肌酸100mg/l。

上述试剂均为普通市售产品。

实施例1

一种赖草愈伤组织扩繁培养基，在ms基础培养基基础上加入如下组分：

30g/l蔗糖，2.5mg/l2，4-二氯苯氧乙酸、0.5mg/l6-苄氨基腺嘌呤，10g/l琼脂，ph5.8。

实施例2

一种赖草愈伤组织扩繁培养基，在ms基础培养基基础上加入如下组分：

35g/l蔗糖，2.0mg/l2，4-二氯苯氧乙酸、0.6mg/l6-苄氨基腺嘌呤，8g/l琼脂，ph5.9。

实施例3

一种赖草愈伤组织扩繁培养基，在ms基础培养基基础上加入如下组分：

25g/l蔗糖，3.0mg/l2，4-二氯苯氧乙酸、0.4mg/l6-苄氨基腺嘌呤，12g/l琼脂，ph5.7。

对比例1

如实施例1所述的赖草愈伤组织扩繁培养基，不同之处在于，将3.0mg/l2，4-二氯苯氧乙酸替换为3.0mg/liaa。

对比例2

如实施例1所述的赖草愈伤组织扩繁培养基，不同之处在于，将0.5mg/l6-苄氨基腺嘌呤替换为0.5mg/l激动素。

对比例3

如实施例1所述的赖草愈伤组织扩繁培养基，不同之处在于，将ms基础培养基替换为1/2ms基础培养基。

实施例4

一种赖草愈伤组织扩繁的培养方法，步骤如下：

(1)将赖草种子去除颖片后，流水浸泡24小时，在无菌环境下用体积百分比70％酒精消毒20s，无菌水清洗，然后用有效氯质量浓度为2％次氯酸钠溶液消毒20min，无菌水清洗，然后分别接种于实施例1-3及对比例1-3制得的赖草愈伤组织扩繁培养基上，在25℃条件下暗培养12小时，然后在23℃条件下暗培养12小时，依次循环变更温度培养条件，30d，挑取生长至0.5cm×0.5cm大小的愈伤组织；

(2)剥离步骤(1)挑取的赖草种胚上的愈伤组织，分别接种到实施例1-3及对比例1-3赖草愈伤组织扩繁培养基上，暗培养40d，制得扩繁后的愈伤组织块；

图1为实施例1的结果照片，图3为采用对比例1的培养结果照片，图4-1和图4-2为采用对比例2的培养结果照片；图5为采用对比例3的培养结果照片，由结果可以看出，对比例1培养获得的愈伤组织多数褐化，对比例2培养获得的愈伤组织为部分暗黄色/部分褐化，对比例3培养获得的愈伤组织多数褐化生根，而实施例1培养获得的愈伤组织均为继代效果非常好的松散的淡黄色透明的愈伤组织；

(3)将步骤(2)制得的扩繁后的愈伤组织块接种至分化培养基，在25℃、16小时光照/天条件下培养30天，获得赖草幼苗；图2-1/图2-2为采用实施例1的结果照片；

所述分化培养基，在ms基础培养基基础上加入如下组分：

30g/l蔗糖、10g/l琼脂、0.5mg/l吲哚丁酸(iba)、0.5mg/l6-苄氨基腺嘌呤(6-ba)。

对比例4

如实施例4所述的赖草愈伤组织扩繁培养基，不同之处在于，采用实施例1制得的赖草愈伤组织扩繁培养基，将步骤(1)中的培养条件替换为25℃条件下暗培养30天愈伤组织，结果如图6-1所示。与实施例4的25℃12h/23℃12h暗室培养30天愈伤组织相比愈伤组织明显要小，如图6-2所示。

实施例5

一种赖草愈伤组织扩繁的培养方法，步骤如下：

(1)将赖草种子去除颖片后，流水浸泡24小时，在无菌环境下用体积百分比70％酒精消毒20s，无菌水清洗，然后用有效氯质量浓度为2％次氯酸钠溶液消毒20min，无菌水清洗，然后接种于实施例1制得的赖草愈伤组织扩繁培养基上，在25℃条件下暗培养共计28d，挑取生长至0.45cm×0.55cm大小的愈伤组织；

(2)剥离步骤(1)挑取的赖草种胚上的愈伤组织块，接种到实施例1制得的赖草愈伤组织扩繁培养基上，暗培养42d，制得扩繁后的愈伤组织块；

(3)将步骤(2)制得的扩繁后的愈伤组织块接种至分化培养基，在25℃、16小时光照/天条件下培养30天，获得赖草幼苗。

实施例6

如实施例4所述的赖草愈伤组织扩繁的培养方法，不同之处在于，采用实施例1制得的赖草愈伤组织扩繁培养基，采用的分化培养基为在1/2ms基础培养基基础上加入如下组分：

30g/l蔗糖、10g/l琼脂、0.5mg/l吲哚丁酸(iba)、0.5mg/l6-苄氨基腺嘌呤(6-ba)。