专利名称：黄芪不定根组织培养方法
技术领域：
本发明公开了一种黄芪不定根组织培养方法，属于中药黄芪组织培养领域。
背景技术：
黄芪是豆科黄芪属多年生草本植物，主根入药。黄芪为中药上品，药用历史悠久，临床应用十分广泛。现代药理研究表明，黄芪具有补气固表，利尿脱毒，敛疮生肌，益气补中之功效，可促进机体的体液免疫和细胞免疫。目前随着保健药日益畅销，黄芪的用药量越来越大，天然资源甚感缺乏，加之黄芪用种子繁殖从播种到收获一般要4～5年，而且出苗率很低(30％～40％)，病虫害影响严重，使品质和产量均有所下降。利用组织培养方法生产黄芪的有用物质具有很大的发展前景，不仅解决国内外市场之需求，而且也是药材生产的根本性变革。黄芪不定根培养具有生长速率快、含量稳定等优点，具有很好的经济效益和社会效益，而目前尚未见到这方面的有关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种黄芪不定根组织培养的方法。该方法快速可行，可以提供均一的培养物。
本发明是通过下述技术方案加以实现的。由黄芪种子出发诱导黄芪不定根的方法，其特征在于包括以下过程将黄芪的种子用70％～75％的乙醇(V/V)浸泡20～30秒后，用无菌水冲洗2～4次后，再用2％次氯酸钠溶液浸泡15～20分钟，然后用无菌水冲洗3～5次，将其接种于不加任何激素的MS培养基中发芽，待无菌芽长到1.0～1.5cm时将芽和子叶分别切下，转接到含有2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)1～4mg/L、α-萘乙酸(NAA)1～4mg/L、6-苄基氨基嘌呤(BA)0～2mg/L的MS培养基中培养，培养17～25天后将形成的愈伤组织切成小块，转接到含有吲哚丁酸(IBA)1～4mg/L、BA 0～2mg/L的MS固体培养基中，经过15～20天的培养即有绒毛状的不定根生成，之后不定根继续生长，将生长18～21天的不定根转接到成分相同的液体培养基中培养，其生长速度更快。
本发明利用生物技术培养黄芪不定根，其生长速率要比原根快得多，并且与细胞培养相比活性次生代谢产物的产率高且比较稳定，为黄芪“GMP”式工业化生产奠定方法基础。
具体实施例方式实例一将内蒙黄芪(购自内蒙古黄芪生产基地)的种子用自来水冲洗干净后，用75％的乙醇浸泡20s，然后无菌水冲洗2～4次，再用2％的次氯酸钠溶液浸泡15min，用无菌水冲洗3～5次后，把种子接种于无激素MS培养基中，培养4d，待芽长到1.0～1.5cm后，将其根中部切成0.5cm的小段，转接到含有2，4-D 1mg/L和BA 1mg/L的MS固体培养基上，20d后将形成的愈伤组织再切成小块，转接到附加IBA 2mg/L和BA 0.2mg/L的MS固体培养基中培养，经过20d的培养即有绒毛状的不定根生成，之后不定根继续生长，将生长20d的不定根转接到成分相同的液体培养基中培养，其生长速度更快。
实例二将黄芪的种子用自来水冲洗干净后，用72％的乙醇浸泡30s，然后用无菌水冲洗2～4次，再用2％的次氯酸钠溶液浸泡20min，用无菌水冲洗3～5次后，把种子接种于无激素MS培养基中，培养4d，待芽长到1.0～1.5cm后，将其根尖切成0.3cm的小段，转接到附加NAA 1mg/L和BA 1mg/L的MS固体培养基上，18d后将形成的愈伤组织再切成小块，转接到附加IBA 2mg/L和BA0.2mg/L的MS固体培养基中培养，经过18d的培养即有绒毛状的不定根生成，之后不定根继续生长，将生长21d的不定根转接到成分相同的液体培养基中培养，其生长速度更快。
实例三将黄芪的种子用自来水冲洗干净后，用71％的乙醇浸泡25s，然后用无菌水冲洗2～4遍，再用2％的次氯酸钠溶液浸泡17min，用无菌水冲洗3～5次后，把种子接种于无激素MS培养基中，培养4d，待芽长到1.0～1.5cm后，将其根顶端切成0.4cm的小段，转接到添加NAA 4mg/L的MS固体培养基上，17d后将形成的愈伤组织再切成小块，转接到含有IBA 1mg/L和BA 0.1mg/L的MS固体培养基中培养，经过19d的培养即有绒毛状的不定根生成，之后不定根继续生长，将生长18d的不定根转接到成分相同的液体培养基中培养，其生长速度更快。
实例四将黄芪的种子用自来水冲洗干净后，用73％的乙醇浸泡23s，然后用无菌水冲洗2～4遍，再用2％的次氯酸钠溶液浸泡19min，用无菌水冲洗3～5次后，把种子接种于MS培养基中，培养3d，待芽长到1.0～1.5cm后，将其子叶切下，转接到添加2，4-D 3mg/L的MS固体培养基上，25d后将形成的愈伤组织再切成小块，转接到添加IBA 2mg/L的MS固体培养基中培养，经过20d的培养即有绒毛状的不定根生成，之后不定根继续生长，将生长21d的不定根转接到成分相同的液体培养基中培养，其生长速度更快。
实例五将黄芪的种子用自来水冲洗干净后，用70％的乙醇浸泡30s，然后用无菌水冲洗2～4遍，再用2％的次氯酸钠溶液浸泡20min，用无菌水冲洗3～5次后，把种子接种于无激素MS培养基中，培养3d，待芽长到1.0～1.5cm后，将其根中部切成0.7cm的小段，转接到附加NAA 2mg/L和BA 1mg/L的MS固体培养基上，19d后将形成的愈伤组织再切成小块，转接到附加IBA 2mg/L和BA 1mg/L的MS固体培养基中培养，经过16d左右的培养即有绒毛状的不定根生成，之后不定根继续生长，将生长19d的不定根转接到成分相同的液体培养基中培养，其生长速度更快。
权利要求
1.一种黄芪不定根组织培养方法，其特征在于包括以下过程将黄芪的种子用70％～75％的乙醇浸泡20～30秒后，用无菌水冲洗2～4次后，再用2％次氯酸钠溶液浸泡15～20分钟，然后用无菌水冲洗3～5次，将其接种于不加任何激素的MS培养基中发芽；待无菌芽长到1.0～1.5cm时将芽和子叶分别切下，转接到含有2，4-二氯苯氧乙酸1～4mg/L、α-萘乙酸1～4mg/L、6-苄基氨基嘌呤0～2mg/L的MS培养基中培养；培养17～25天后将形成的愈伤组织切成小块，转接到含有吲哚丁酸1～4mg/L、BA 0～2mg/L的MS固体培养基中，经过15～20天的培养即有绒毛状的不定根生成，之后不定根继续生长，将生长18～21天的不定根转接到成分相同的液体培养基中培养，其生长速度更快。
全文摘要
本发明公开了一种黄芪不定根组织培养方法，属于中药黄芪组织培养领域。本发明首先采用70％～75％乙醇(V/V)、2％次氯酸钠(V/V)浸泡黄芪种子以消毒灭菌，并接种于MS培养基中培养诱导无菌芽；然后将切下的子叶和芽转到含不同植物生长调节剂的MS培养基中诱导愈伤组织；之后将愈伤组织转到附加吲哚丁酸和激动素的MS培养基中诱导不定根；最后将不定根转接到含相同植物生长调节剂的液体培养基中培养，其生长速度更快。本发明具有过程简单，诱导率高，不定根增殖快等特点。
文档编号A01H4/00GK1653887SQ20051001627
公开日2005年8月17日 申请日期2005年3月8日 优先权日2005年3月8日
发明者高文远, 陈海霞, 郭肖红, 陈巍 申请人:天津大学