基于AquaOBP4的绿色植物源榆紫叶甲野外诱捕器设计的制作方法

技术领域：本发明属于农业病虫害防御技术，具体涉及一种榆紫叶甲野外诱捕装置。

背景技术：

榆树，属榆科榆属落叶乔木。因其生长迅速、繁殖力强、适应性广，既耐寒冷、干旱、瘠薄，又耐盐碱，是北方植树造林、防风固沙、生态防护的主要树种。近年来由于榆紫叶甲猖獗发生，严重影响我国东北地区榆树的正常生长，给经济和生态造成了巨大损失。

榆紫叶甲，属鞘翅目叶甲科，是危害榆树的单食性害虫，国内分布于黑龙江、吉林、辽宁、河北、贵州等省和内蒙古自治区，国外分布在俄罗斯西伯利亚。榆紫叶甲繁殖能力强，因缺少有效防治手段，连年危害，早春专食榆树叶芽，致其不能长出叶片，造成树势衰弱，生长缓慢，成为“小老树”或“干枝梅”。

营林措施，物理防治，化学防治，生物防治，这4种方法是目前防治榆紫叶甲的主要防治方法。但存在效率低下、费事费力、适用范围较窄、污染环境、成本过高等缺点。以上提到的四种方法均不能安全有效的控制榆紫叶甲对榆树的破坏，因此探究新的防治方法显得尤为重要。

空气当中，存在着极为丰富的信息分子，这些信息分子对昆虫的一系列行为活动具有重要的调控作用，例如交配、产卵、觅食、寻找寄主。昆虫同样也进化成了高度专一和极其敏感的嗅觉系统来识别这些信息分子。昆虫的嗅觉感受过程是把化学信号转化为电信号的过程，而完成这一过程需要大量的外周嗅觉蛋白的参与才能完成，而大多情况下是在气味结合蛋白的参与下完成的。研究发现aquaobp4与榆紫叶甲体内的其他气味结合蛋白相比，具有很高的触角特异性，在榆紫叶甲触角中的表达量最高。为了充分利用aquaobp4的这一功能和选择性，我们通过表达和纯化这种蛋白质，并对与之相关的活性气味进行筛选，通过对aquaobp4的序列进行同源模版筛选，建立一个可靠的分子筛选模型，利用所获得的数据，更好地了解obp结构与活性气味之间的相互作用，获得了结合能力较强的几种配体。然后再进行触角电生理反应和行为学验证来确定最佳诱剂。将这一最佳配体化合物作为诱捕器的诱芯，利用aquaobp4与之的强结合能力，对今后防治榆紫叶甲提供了新的可行的方法。

与以往利用昆虫对特定波长的光波、颜色、化学物质、声波等具有强烈趋向性的原理，研制出的黑光灯、诱虫色板、性诱剂诱捕器等用来捕杀或捕捉昆虫设备相比，我们的诱捕器是与昆虫的觅食相关的，是一种基于aquaobp4的绿色植物源榆紫叶甲野外诱捕器。

技术实现要素：

(一)要解决的技术问题

本发明的目的，是根据在榆紫叶甲触角上高表达的aquaobp4能够高效的识别、结合信号分子，通过建立一个可靠的aquaobp4空间构象模型，来确定结合能力最强的配体，利用能与aquaobp4较强结合的化合分子作为诱捕器的诱芯，来高效的防治榆紫叶甲。该方法与之前四种方法相比，具有防治效果明显，对劳动力要求少，耗时少，防治成本较低，受环境影响小的优点，是目前为止防治榆紫叶甲最成熟的方法。

(二)技术方案

为达到上述目的，我们以最佳化合物作为榆紫叶甲野外诱捕器的诱芯，来防治榆紫叶甲虫害。诱捕器包括防雨盖、透明挡板、诱剂存放罐、集虫装置。防雨盖是为了防治灰尘和雨水进入诱剂存放罐中，影响诱剂的正常挥发和浓度；透明挡板将空间分为几个部分，可以干扰昆虫的视线，在昆虫飞扑过来后，撞晕并掉落在集虫装置中；诱剂存放罐中存放有能与aquaobp4高效结合的配体化合物，引诱昆虫飞扑过来；集虫装置中装有酒精、洗衣粉、洗洁精或油等，落入水中的榆紫叶甲，既因后翅受水中溶剂的干扰而不能从水中爬出，又因水瓶壁太光滑而不能通过瓶壁逃走，最终因能量消耗怠尽而溺死在水中。

而本发明最关键的步骤是确定诱芯中配体化合物的成分，充分利用其能与aquaobp4高效结合的特点，来对榆紫叶甲进行有效的防治。化合物的成分我们可以通过以下步骤实现:

1.诱芯化合物成分确定

(1)基于aquaobp4的绿色功能化合物筛选

自然界昆虫的一系列行为活动受空气中的信号分子调控的，而为了识别这些信号分子，昆虫的嗅觉进化的越来越灵敏。识别信号分子这一过程，主要是在气味结合蛋白的参与下完成的。在所有的气味结合蛋白中，aquaobp4表现的最为敏感和活跃，同时aquaobp4在榆紫叶甲的触角中表达量相当高，并具有极高的特异性。因此，我们把aquaobp4作为本次研究对象。通过表达载体构建，蛋白表达与纯化过程成功获得了无his标签的aquaobp4纯蛋白。

(2)初步确定能与aquaobp4较强结合的配体化合物

我们根据aquaobp4能与配体较强结合的原理，对现有昆虫野外诱捕器的诱芯部分进行改良设计而实现对榆紫叶甲较好的防治。因此，首先要确定最佳配体的身份。我们选择了40种候选配体化合物进行荧光竞争结合实验，其中与榆紫叶甲生境相关的39种化合物和最新发现的对榆紫叶甲具有趋避作用的cinnamaldehyde作为荧光竞争结合的配体，结果如图1所述，根据所获得的结果使用graphpadprism软件进行绘制如图3所示，我们可以发现aquaobp4与其中的五种化合物有较高水平的结合。

(3)建模和功能化合物筛选

对aquaobp4的序列(去除信号肽)进行同源模版筛选。得到aquaobp4与dmelobplush同源性最高，在on-lineswiss-modelsoftware上进行aquaobp4的模型构建。在进行分子对接之前，将有结合能力的5个化合物的分子结构用sketchmode进行构造。经过分子对接发现，aquaobp4具有两个结合位点如图4所示。其中site1位于结合域的中心，处于螺旋α1,α2和α3中间，特别是被细长的疏水基团α3所环绕。site2则位于site1的左侧与后侧螺旋α4和α5所相近。

(4)aquaobp4的蛋白空间结构模型和功能化合物进行分子对接

为了探究构建的蛋白空间构象模型是否可靠，作者在候选榆树和成虫粪便挥发物中根据有结合的5种配体的化学结构，选取了两个类似物(butyloctylphthalate,isoeugenol)有可能与aquaobp4结合的气味配体，进行分子对接。我们将以上7种化合物与aquaobp4的结合能力做了一个分数评估，结果如图2所示。

(5)功能化合物eag和行为学检验

为了进一步测试与aquaobp4相结合的三种最佳配体的生物功能，我们对其进行了eag和y-试管的检测。dibutylphthalate,diisobutylphthalate和butyloctylphthalate都引起了强烈的触角电生理反应(如图6)。然而，当对这三种配体进行不同浓度的测试时，检测到的触角电生理反应没有明显的变化(图5)。y-试管嗅觉测量仪的结果显示(如图7)，这三种被检测的气味都能吸引榆紫叶甲的成虫(1μg/μl)。在有气味的一侧，昆虫的数量要远远大于控制侧的数量(p<0.01)。此外，在三种检测的气体中没有发现明显的差异，而dibutylphthalate对榆紫叶甲的吸引力稍高一些。因此，我们以dibutylphthalate为诱捕器的诱芯。

2.基于上述最佳配体化合物为诱芯，制作诱捕器

(1)防雨盖的制作

防雨盖是一个铁皮圆锥体，是为了防治灰尘和雨水进入诱剂存放罐中，影响诱剂的正常挥发和浓度。它的侧边和透明挡板的顶部固定在一起。

(2)挡虫板的制作

挡虫板挡虫板由3块厚度4mm的塑板制作而成,三个透明挡板将空间分为三个部分，透明挡板可以干扰昆虫的视线，在昆虫飞扑过来后，撞晕并掉落在集虫装置中。透明挡板的上方和防雨盖固定在一起，下方通过漏斗与集虫装置连接。

(3)诱剂存放罐的制作

被透明挡板分隔开的三个部分，都安装有一个诱剂存放罐，存放罐固定在透明挡板上，在诱剂存放罐中加入dibutylphthalate试剂，存放罐的上方有胶塞，胶塞上有小孔，以方便诱剂的挥发。

(4)集虫装置的制作

集虫装置包括一漏斗状的铁皮和收集装置组成，铁皮和透明挡板相连，昆虫受化合物的吸引飞扑过来时容易撞到透明挡板，装晕后即落入集虫装置中。

本方法的用途与优越性(有益效果)

1、本发明成本较低，人力劳力投入较少；

2、本发明为自动诱捕系统，可实现24小时全天候无人诱捕；

3、本发明与以往的高毒化学防治相比，具有对环境影响小，环保的优点；

4、本发明是利用dibutylphthalate这种功能性绿色防治化合物，对环境无污染，在大面积防治时也能起到很好的控制效果。而且诱捕器具有可以批量生产的特点，使用过程也具有省时省力的特点；

5、该发明既可以独立使用，也可以与其他防治方法结合，形成综合防治系统；

附图说明

图1是气味配体与榆紫叶甲aquaobp4结合特性。

图2是与aquaobp4有结合的5种配体和用于预测的2种配体的结构，结合力与得分。

图3是aquaobp4与气味分子竞争结合图。

图4是aquaobp4的两个不同的结合位点site1(蓝绿色)和site2(粉色)。

图5是在三个不同浓度下来测试三种配体的剂量依赖曲线。

图6是在1g/l的浓度下，3个测试气味的相对触角电生理的反应。

图7是y-试管嗅觉测量仪对三种检测气味进行行为学验证的结果。

图8是我们本专利设计发明的榆紫叶甲野外诱捕器的立体设计图。

图9是我们本专利设计发明的榆紫叶甲野外诱捕器的三视图。

图10是我们本专利设计发明的榆紫叶甲野外诱捕器的尺寸大小。

具体实施方式

方案中举例应用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

一、诱芯化合物成分的确定

1.榆紫叶甲触角总rna的提取，合成cdna，引物设计，进行pcr扩增，pet28a-obp4表达载体构建和诱导表达以及其蛋白纯化与定量分析，将配体与荧光探针进行竞争结合。

2.利用aquaobp4的序列进行同源模版筛选。在on-lineswiss-modelsoftware上进行aquaobp4的模型构建；将有结合能力的5个化合物的分子结构用sketchmode进行构造，并与之进行分子对接。为了探究构建的蛋白空间构象模型是否可靠，选取了两个类似物与其进行分子对接。

3.用一台pc-10微管制造玻璃电极，将参考电极插入到榆紫叶甲的眼睛里，然后把记录电极放置在触角的截短尖端。用一个注射器筒作为容器将气味溶液溶解在不同剂量的石蜡油中。将气味溶液滴在滤纸上，然后放在注射器筒里。气味剂在一定的气流下被输送到距离触角大约1厘米的地方。

4.脉冲持续时间为0.1秒，而记录时间设置为4秒，间隔2分钟。至少有6个个体(3个雄性和3个雌性)接受了每一个重复的测试，分别为0.1g/l、1g/l和10g/l；以10g/l的中等浓度进行测试。20μl的气味被滴到一张滤纸上，然后将滤纸放置在一个嗅觉计的手臂上。另一个手臂，在一张滤纸上滴加20μl的石蜡，被用来作为负控制。

二、基于上述最佳配体化合物为诱芯，制作诱捕器

1.昆虫诱捕器主要包括防雨盖、多块透明挡板、集虫装置和诱剂存放罐如图8、9、10所示；

2.所述集虫装置顶部设有防雨盖，为了避免雨水、灰尘等落入诱剂存放罐中，污染诱芯化合物；顶部具有昆虫落入的入口；按照图8所示的比例进行制作,所述透明挡板与所述入口平面垂直，并且所述透明挡板的一条侧边底部固定于所述入口处，透明挡板的顶部侧边与诱捕器的顶部防雨盖相连接，三块透明挡板的内部侧边连接在一起，将空间分割成三个部分，三个诱剂存放罐中均存放有诱剂。在每个部分都安装有一个诱剂存放罐，存放罐固定在玻璃挡板上，在诱剂存放罐中加入dibutylphthalate试剂，存放罐的上方有胶塞，胶塞上有小孔，以方便诱剂的挥发；

3.所述诱剂存放罐上设有诱剂挥发孔。由于采用透明挡板，昆虫飞扑过来时容易撞到透明挡板，装晕后即落入集虫装置中，相比于采用非透明挡板(昆虫一般靠视觉飞行，昆虫遇到非透明挡板后停靠在挡板上，继而逃逸)，本方案中诱捕到昆虫的几率大得多。

4.另外，诱剂存放罐是固定在玻璃挡板上的，不易掉落，而且每个部分都安装有一个诱剂存放罐，诱剂存放罐上设有诱剂挥发孔，可以增大空间中诱剂的浓度，使得每个方位都有诱剂的分布，这样可以使诱剂全面挥发，提高诱捕效率。