本发明涉及一种虎牙石斛组织培养方法。
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：虎牙石斛，即藏南石斛(学名：dendrobiummonticolap.f.huntetsummerh.)生于海拔1750-2200米的山谷岩石上。分布于中国广西西南和西藏南部，印度西北部经尼泊尔到锡金和泰国也有分布。它具有丰富的活性多糖，具有药用价值。它的通常具有总状花序常1-4个，顶生或从当年生具叶的茎上部发出，近直立或弯垂，长2.5-5厘米，具数朵小花；花开展，白色；花瓣狭长圆形，先端渐尖，唇瓣近椭圆形中部稍缢缩，中部以上3裂，基部具短爪，极具观赏性，具有较高的园艺价值。虎牙石斛是一种喜阴凉的多年生草本植物，喜在温暖、潮湿、以年降雨量1000毫米以上、半阴半阳的环境，1月平均气温高于8℃的亚热带深山老林中生长为佳，适宜生长温度为15到28度，适宜生长空气湿度为60％以上，对土肥要求不甚严格，野生多在疏松且厚的树皮或树干上生长，有的也生长于石缝中。属气生根系，主要要求根部通透性好，采用的基质最好能通风透气滤水，在适宜的温度湿度下，生长速度快，生存能力非常强。每年春末夏初，二年生茎上部节上抽出花序，开花后从茎基长出新芽发育成茎，秋冬季节进入休眠期。目前，虎牙石斛的人工培育包括分株繁殖、扦插繁殖、分芽繁殖，但是，上述繁殖方式繁殖效率低，不能满足市场需求，因此，需要利用植物组织培养技术对虎牙石斛进行快速繁殖。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种虎牙石斛组织培养方法。为实现本发明的目的，本发明采用以下技术方案：一种虎牙石斛组织培养方法，包括虎牙石斛种子培养萌发成圆球茎，壮苗培养，诱导生根，炼苗四个步骤，其中所述虎牙石斛种子培养萌发成圆球茎、壮苗和诱导生根中使用的培养基分别如下：一、种子培养基培养基配方二、壮苗培养基配方试剂名称规定量(mg/l)试剂名称规定量(mg/l)硝酸钾1900硫酸亚铁27.8硝酸铵1650甘氨酸2.0硫酸镁370盐酸硫胺素0.2磷酸二氢钾170盐酸吡哆醇0.65氯化钙550烟酸0.5硫酸铜0.025肌醇50氯化钴0.025naa1-10硫酸锰16.96-ba5-10硫酸锌8.6香蕉200000硼酸6.2碳粉500碘化钾0.83蔗糖30000钼酸钠0.25na2-edta37.3三、生根培养基配方试剂名称规定量(mg/l)试剂名称规定量(mg/l)硝酸钾1550硫酸亚铁27.8硝酸铵1250甘氨酸2.0硫酸镁260盐酸硫胺素0.2磷酸二氢钾130盐酸吡哆醇0.65氯化钙450烟酸0.5硫酸铜0.025肌醇5氯化钻0.025naa1-10硫酸锰16.96-ba0.1-10硫酸锌8.6香蕉100000硼酸6.2碳粉500碘化钾0.83蔗糖18000钼酸钠0.25艾比蒂生根粉0.1-1na2-edta35.3所述种子培养萌发成圆球茎步骤中，成熟虎牙石斛种子经消毒处理后播种于种子培养基中培养，一星期转绿，继续培养20-30天，经过种胚膨大、萌发形成绿色圆球茎；培养条件为25-26℃，光照为1600-1800lx，光照时间为10h/d。所述的消毒处理过程为：自来水加洗洁精冲洗3分钟后用75％酒精消毒30秒，之后用35％双氧水消毒10分钟，然后用无菌水冲洗三次。所述壮苗培养步骤中，圆球茎转入壮苗培养基中进行壮苗培养，经过80-90天壮苗培养，获得高度达到1.5-3cm的幼苗，培养条件：温度25-26℃，光照度1900-2100lx，光照时间为12h/d。本发明具有以下优点：1.本发明提供虎牙石斛的组织培养方法，虎牙石斛种子萌发率高，在90％以上，获得的幼苗粗壮，主根系发达，种植成活率在90％以上，大大地提高繁殖效率。2.种子培养基对虎牙石斛种子的萌发有重要影响，本发明提供的种子培养基可以使虎牙石斛种子萌发在90％以上。3.本发明采用的壮苗培养基可以促进圆球茎生成粗壮的幼苗。4.本发明采用的生根培养基可以促进幼苗生根，所得的主根系发达，有利于在炼苗及种植中成活。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制，任何在本发明权利要求范围内所做的有限修改，仍在本发明的权利要求保护范围内。实施例1虎牙石斛组织培养分四个阶段，分别是种子萌发、壮苗培养、诱导生根和炼苗四个阶段，所以在本发明提供的虎牙石斛组织培养方法包括虎牙石斛种子萌发成为圆球茎，壮苗，生根，炼苗四个步骤，具体培养过程如下：(1)种子萌发成为圆球茎：取成熟虎牙石斛种子进行消毒处理，用自来水加洗洁精冲洗3分钟，然后75％酒精消毒30秒，再用35％双氧水消毒10分钟，最后用无菌水冲洗三次后播种于种子培养基中培养，一星期转绿，继续培养20-30天，经过种胚膨大、萌发形成绿色圆球茎，种子的萌发率在90％以上。培养条件为25-26℃，光照为1600-1800lx，光照时间为10h/d。(2)壮苗培养：将步骤(1)中产生的圆球茎转入壮苗培养基中进行壮苗培养，经过80-90天壮苗培养，高度达到1.5-3cm的粗壮幼苗出现，培养条件：温度25-26℃，光照度1900-2100lx，光照时间为12h/d。(3)诱导生根：将步骤(2)得到的幼苗转入生根培养基进行诱导生根，长成具有发达主根系的生根苗。(4)炼苗：将步骤(3)得到的生根苗进行炼苗驯化，使其适应外部生长环境。完成炼苗后，所得驯化苗移栽大棚或室外，同时种植管理，驯化苗成活率在90％以上。种子培养基配方试剂名称规定量(mg/l)试剂名称规定量(mg/l)硝酸钾1700硫酸亚铁27.8硝酸铵1350甘氨酸2.0硫酸镁360盐酸硫胺素0.1磷酸二氢钾160盐酸吡哆醇0.5氯化钙430烟酸0.5硫酸铜0.025肌醇100氯化钴0.025naa1-10硫酸锰15.96-ba5-10硫酸锌7.6马铃薯100000硼酸5.2碳粉250碘化钾0.83蔗糖30000钼酸钠0.25水解乳蛋白700na2-edta37.3壮苗培养基配方试剂名称规定量(mg/l)试剂名称规定量(mg/l)硝酸钾1900硫酸亚铁27.8硝酸铵1650甘氨酸2.0硫酸镁370盐酸硫胺素0.2磷酸二氢钾170盐酸吡哆醇0.65氯化钙550烟酸0.5硫酸铜0.025肌醇50氯化钴0.025naa1-10硫酸锰16.96-ba5-10硫酸锌8.6香蕉200000硼酸6.2碳粉500碘化钾0.83蔗糖30000钼酸钠0.25na2-edta37.3生根培养基配方种子培养基中的naa的规定量在1-10mg/l范围内调整，6-ba的规定量在5-10mg/l范围内调整，都能够使虎牙石斛种子萌发率达到90％以上。如，naa的规定量为1mg/l、1.5mg/l、2mg/l、2.5mg/l、3mg/l、3.5mg/l、4mg/l、4.5mg/l、5mg/l、5.5mg/l、6mg/l、6.5mg/l、7mg/l、7.5mg/l、8mg/l、8.5mg/l、9mg/l、9.5mg/l和10mg/l均可。6-ba的规定量为5mg/l、5.5mg/l、6mg/l、6.5mg/l、7mg/l、7.5mg/l、8mg/l、8.5mg/l、9mg/l、9.5mg/l和10mg/l均可。壮苗培养基中的naa的规定量在1-10mg/l范围内调整，6-ba的规定量在5-10mg/l范围内调整，都能够使虎牙石斛的圆球茎长出粗壮的幼苗。如，naa的规定量为1mg/l、1.5mg/l、2mg/l、2.5mg/l、3mg/l、3.5mg/l、4mg/l、4.5mg/l、5mg/l、5.5mg/l、6mg/l、6.5mg/l、7mg/l、7.5mg/l、8mg/l、8.5mg/l、9mg/l、9.5mg/l和10mg/l均可。6-ba的规定量为5mg/l、5.5mg/l、6mg/l、6.5mg/l、7mg/l、7.5mg/l、8mg/l、8.5mg/l、9mg/l、9.5mg/l和10mg/l均可。生根培养基中的naa的规定量在1-10mg/l范围内调整，6-ba的规定量在5-10mg/l范围内调整，艾比蒂生根粉的规定量在0.1-1mg/l范围内调整，幼苗长出发达的主根系。如，naa的规定量为1mg/l、1.5mg/l、2mg/l、2.5mg/l、3mg/l、3.5mg/l、4mg/l、4.5mg/l、5mg/l、5.5mg/l、6mg/l、6.5mg/l、7mg/l、7.5mg/l、8mg/l、8.5mg/l、9mg/l、9.5mg/l和10mg/l均可。6-ba的规定量为5mg/l、5.5mg/l、6mg/l、6.5mg/l、7mg/l、7.5mg/l、8mg/l、8.5mg/l、9mg/l、9.5mg/l和10mg/l均可。艾比蒂生根粉的规定量为0.1mg/l、0.2mg/l、0.3mg/l、0.4mg/l、0.5mg/l、0.6mg/l、0.7mg/l、0.8mg/l、0.9mg/l、1mg/l均可。当前第1页12