本发明涉及一种烟草外植体防褐化方法，具体是一种基于活性炭和维生素c的烟草外植体防褐化方法，属于植物组织培养领域。
背景技术：
褐化是植物组织培养过程中影响组织培养的重要因素，褐化是植物材料受伤后，体内释放的酚类物质在酚氧化酶的作用下被氧化成褐色的醌类物质的结果，对外植体材料将产生毒害作用，影响其生长和分化，严重时导致死亡。对于引起植物组织褐化的因素已有研究报道，影响褐化的因素主要分为内因和外因，尽管引起褐化现象的因素较多，但选择合适的外植体，筛选合适的培养基和培养条件能有效地防止褐化。通常条件下通过添加抗氧化剂或吸附剂可以有效降低褐化率。
众所周知，烟草（nicotianatabacum）是我国重要经济作物之一。在长期以来的探索中，烟草作为组织培养中一种繁殖力强、抗病毒能力强、生长旺盛的实验品种。但是烟草在组织培养过程中的褐化问题是多发的常见的，几乎不可避免，褐化会导致植株的死亡，也就是培养基中的植物不能继续进行培养，所以防止褐化是在烟草组织培养中要极力解决的问题。
针对烟草的特殊性，单一防褐化剂的添加并不能很好的达到防褐化效果，还需要辅助其他防褐化的手段，通过不同的防褐化剂的协同作用，有可能无需辅助其他防褐化的手段，并能产生其他意外的效果，值得探索，对于烟草外植体，使用不同的防褐剂且不需其他防褐化的手段的相关方法未见报道。
技术实现要素：
为了解决上述为问题，本发明的目的在于提供一种基于活性炭和维生素c的烟草外植体防褐化方法，无需其他防褐化手段的辅助，即可有效缓解烟草组培过程中出现的褐化问题。
本发明采用解决技术问题方案如下：
一种基于活性炭和维生素c的烟草外植体防褐化方法，包括如下步骤：
步骤（1），种子的消毒；
步骤（2），种子培养：将步骤（1）得到的种子接种到ms培养基中培养，种子发芽长成幼苗；种子的培养条件为：在培养温度为25±1℃，光照强度30-50μmol/(m2·s)，光照时间为16h/d的条件下培养60d；
步骤（3），烟草外植体培养：将步骤（2）中得到的幼苗，利用打孔器进行打孔得到烟草叶盘，将叶盘置于ms分化培养基中培养，培养条件为：28℃光照培养16h/d，光照强度30-50μmol/(m2·s)，25℃黑暗培养8h/d，培养5d，得到外植体；
步骤（4），防褐化培养：将步骤（3）中得到的外植体置于ms防褐化培养基中，在28℃光照培养16h/d，光照强度30-50μmol/(m2·s)，25℃黑暗培养8h/d的条件下培养40d，ms防褐化培养基为ms基本培养基中添加0.3-1.0g/l活性炭、10-50mg维生素c、30g/l蔗糖和4g/l的琼脂，培养基的ph值为5-6。
进一步地，步骤（1）中，种子消毒的具体步骤为：取饱满的烟草种子，然后移至超净工作台上，用75％酒精将种子浸泡30s，无菌水冲洗2遍，再用1％agno3消毒10min，无菌水浸泡清洗5次，用无菌滤纸吸干外植体表面水分后进行接种，其中无菌水为经高压灭菌的超纯水。
进一步地，步骤（2）中，ms培养基为ms基本培养基中添加30g/l蔗糖和4g/l的琼脂，培养基的ph值为5.7。
进一步地，步骤（3）中，ms分化培养基为ms基本培养基中添加0.5mg/l的萘乙酸naa、2mg/l的6-苄基腺嘌呤6-ba、30g/l蔗糖和4g/l琼脂，培养基的ph值为5.7。
进一步地，步骤（4）中，ms防褐化培养基的制备方法如下：
a、维生素c溶液制备：称取维生素c溶于无菌水中，使用滤头过滤灭菌，用无菌ep管分装，保存-20℃左右冰箱备用，得到浓度10mg/ml维生素c溶液；
b、1lms防褐化培养基配制：将4.43gms基本培养基、30g蔗糖和1l超纯水混合，并调节ph值为5.7；
c、添加0.3-1.0g活性炭和4g琼脂，灭菌；
d、冷却至50℃左右，加入10-50mg步骤a的维生素c溶液，摇匀，即得到ms防褐化培养基。
本发明与现有技术相比，其有益效果为：
相比对照，在培养基中添加适量活性炭与维生素c，不仅可以有效缓解外植体褐化现象，无需其他防褐化手段，褐化率为9.1-18.3%，同时，活性炭与维生素c协同，更有效刺激植物细胞分裂、改善氧化-还原，有效地促进了烟草外植体快速出芽，最快5d即可诱导出芽。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
实施例1
本实施例的基于活性炭和维生素c的烟草外植体防褐化方法，包括如下步骤：
步骤（1），种子的消毒：取饱满的烟草种子，然后移至超净工作台上，用75％酒精将种子浸泡30s，无菌水冲洗2遍，再用1％agno3消毒10min，无菌水浸泡清洗5次，用无菌滤纸吸干外植体表面水分后进行接种，其中无菌水为经高压灭菌的超纯水。
步骤（2），种子培养：将步骤（1）得到的种子接种到ms培养基中，在培养温度为25±1℃，光照强度45μmol/(m2·s)，光照时间为16h/d的条件下培养60d，种子发芽长成幼苗，所述种子ms培养基为ms基本培养基中添加30g/l蔗糖和4g/l的琼脂，培养基的ph值为5.7；
步骤（3），烟草外植体培养：将步骤(2)中得到的幼苗，利用打孔器进行打孔得到烟草叶盘，将叶盘置于ms分化培养基中，在28℃光照培养16h/d，光照强度30-50μmol/(m2·s)，25℃黑暗培养8h/d，培养5d，得到外植体；所述叶盘ms分化培养基为ms基本培养基中添加0.5mg/l的萘乙酸naa、2mg/l的6-苄基腺嘌呤6-ba、50mg/l维生素c、0.2g/l活性炭、30g/l蔗糖和4g/l的琼脂，培养基的ph值为5.7；
步骤（4），防褐化培养：将步骤(3)中得到的外植体置于ms防褐化培养基中，28℃光照培养16h/d，光照强度30-50μmol/(m2·s)，25℃黑暗培养8h/d的条件下培养40d，ms防褐化培养基的制备方法如下：
a、维生素c溶液制备：称取1g维生素c溶于100ml无菌水中，使用0.22μm滤头过滤灭菌，用1.5ml无菌ep管分装，保存-20℃冰箱备用，得到浓度10mg/ml维生素c溶液；
b、1lms防褐化培养基配制：将4.43gms基本培养基、30g蔗糖和1l超纯水混合，并调节ph值为5.7；
c、添加0.6g/l活性炭和4g琼脂，在121℃下灭菌15min；
d、冷却至50℃左右，加入50mg步骤a的维生素c溶液，摇匀，即得到ms防褐化培养基。1l的ms防褐化培养基约可倒100mm培养皿30个，150mm培养皿10个，300ml培养瓶15个。
本实施例中，外植体褐化率为9.1％。8d后即诱导出芽。
实施例2
本实施例的基于活性炭和维生素c的烟草外植体防褐化方法，其中：
步骤（1）-（3）与实施例1相同；
步骤（4），防褐化培养：将步骤(3)中得到的外植体置于ms防褐化培养基中，在28℃光照培养16h/d，光照强度30-50μmol/(m2·s)，25℃黑暗培养8h/d的条件下培养40d，ms防褐化培养基的制备中：
将4.43gms基本培养基、40g蔗糖和1l超纯水混合，并调节ph值为5.7；添加1g/l活性炭和4g琼脂，在121℃下灭菌15min；加入50mg维生素c溶液。其余步骤与实施例1相同。
本实施例中，外植体褐化率为17.6％，5d后即诱导出芽。
实施例3
本实施例的基于活性炭和维生素c的烟草外植体防褐化方法，其中：
步骤（1）-（3）与实施例1相同；
步骤（4），防褐化培养：将步骤(3)中得到的外植体置于ms防褐化培养基中，在28℃光照培养16h/d，光照强度30-50μmol/(m2·s)，25℃黑暗培养8h/d的条件下培养40d，
ms防褐化培养基的制备中：
将4.43gms基本培养基、30g蔗糖和1l超纯水混合，并调节ph值为5.9；添加0.6g/l活性炭和4g琼脂，在121℃下灭菌15min；加入30mg维生素c溶液。其余与实施例1相同。
本实施例中，外植体褐化率为18.3％。9d后即诱导出芽。
对照实验：
对照实验分别为培养基不添加活性炭和维生素c、培养基仅添加活性炭和培养基仅添加维生素c，其余与实施例1相同，结果如表1所示：
表1对照与实施例1-3的效果对比
由表1可以看出，同时添加活性炭与维生素c，比单一添加活性炭或维生素c效果更好，而且从上述数据来看，这样的效果并不仅仅是两者的简单叠加，有一定的相互促进的作用，不仅仅改善了褐化率，更有效刺激植物细胞分裂、改善氧化-还原，有效地促进了烟草外植体快速出芽。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。