本发明涉及一种高轮环藤宁和千金藤素含量的地不容的组培繁育方法，属于植物领域。
技术背景
地不容(stephaniaepigaea)是防己科(menispermaceae)千金藤属(stephania)山乌龟亚属植物，本属植物具有硕大块根且裸露于地面形似乌龟，因此别名称“山乌龟”，是我国的传统中草药，其块根入药，在长江流域以南各地尤其是华南和西南等地少数民族中使用广泛。
地不容富含千金藤素、轮环藤宁等生物碱，前者用于白细胞增生剂千金藤素片的研药，后者是环轮宁(轮环藤宁双溴甲烷盐)的前体。通过在滇西、滇西南和部分广西等地野外地不容资源调查，对不同生态位的30个地不容居群，每个居群分别选雌、雄株各20株，共600余株，选裸露于地面块茎直径在10～20cm的药用部位进行高效液相含量测定，筛选得到雌株和雄株雄中高含千金藤素(cepharanthine)和轮环藤宁(cycleanine)的品系
高轮环藤宁和千金藤素含量的地不容在组培中也存在有诸多问题，例如芽增殖系数偏低，生根困难等技术难题。黄宁珍等(2007，广西地不容组培快繁研究)以嫩茎节段为外植体，在ms+ba1.0mg·l-1+naa0.1mg·l-1培养基上先诱导出芽，再经过3种培养基交替培养，增殖系数也仅为6.0倍/50d。发明人在实验研究地不容组培快繁中发现，芽增殖过程中，激素ba浓度在1.0～3.0mg·l-1时，偏向于愈伤组织的形成，对芽的增值效果不佳，把带芽的愈伤组织转接到ms+ba0.4～0.8mg·l-1+naa0.2mg·l-1上有不定芽的分化，而切除上部芽的愈伤很难分化出不定芽，需要更长时间的诱导且数量极少，原因可能是愈伤上部的芽合成一些微量物质而促进不定芽的分化，而使用文献中提供的生根培养基无法使高轮环藤宁和千金藤素含量的地不容生根，直接造成无法获得能够成活的地不容组织。
综上所述，目前高轮环藤宁和千金藤素含量的地不容的组培快速繁殖存在有增殖系数低、诱导不定芽难、生根难等技术问题，阻碍了地不容的快速繁殖。
技术实现要素：
针对上述技术问题，发明人提供了一种高轮环藤宁和千金藤素含量的地不容的组培繁育方法，其中，所述组织繁育方法包括以下步骤：
1)芽诱导，选取高轮环藤宁和千金藤素含量的地不容带节嫩茎段为外植体，经过灭菌操作，接种到芽诱导培养基上培养，所述芽诱导培养基配方为1/2ms+ba
0～0.5mg·l-1+iba0～0.2mg·l-1，诱导新芽；
2)愈伤诱导，当新芽长到2～3cm后剪切转接到愈伤诱导培养基上培养，所述愈伤诱导培养基为ms+ba1.0～2.0mg·l-1+naa0.2mg·l-1，诱导带芽愈伤；
3)不定芽分化，将带芽的愈伤接到不定芽诱导分化培养基上培养，所述不定芽分化培养基配方为ms+ba0.4～0.8mg·l-1+naa0.2mg·l-1，诱导不定芽；
4)生根培养，剪切不定芽尖转接到生根培养基上培养，所述生根培养基配方为1/2ms+iba0.5～1.0mg·l-1+嘧啶醇1.0～2.0mg·l-1，诱导生根；
5)炼苗，当步骤4)诱导出根6～9根，长3～5cm后，进行炼苗3～5天；
6)移栽，清洗干净根上的培养基，移栽到装有灭菌处理的土壤基质，浇水；
7)水、肥及病虫害预防管理，即得所需地不容待大田移栽壮苗。
在上述高轮环藤宁和千金藤素含量的地不容组培繁育方法，其中，步骤1)所述地不容外植体选取时间为每年公历3-4月份。本方法中嫩茎段能显著提地不容的组培繁殖系数，外植体选取中以截取嫩茎段优先；
在上述高轮环藤宁和千金藤素含量的地不容组培繁育方法，其中，步骤1)所述灭菌操作为流水冲洗30min，使用75％酒精水溶液浸泡20-30s，0.2％hgcl2灭菌6-10min后，无菌水漂洗后，擦干。
在上述高轮环藤宁和千金藤素含量的地不容组培繁育方法，其中，步骤1)所述芽诱导培养基配方优选1/2ms+6ba0.5mg·l-1+iba0.1mg·l-1。该方法中ms为murashige和skoog培养基；1/2ms为稀释1倍的ms培养基，ba为6苄基嘌呤，iba为吲哚丁酸(下同)
在上述地不容组培繁育方法，其中，步骤2)所述愈伤诱导培养基
ms+ba1.5mg·l-1+naa0.2mg·l-1。该方法中naa为萘乙酸(下同)，ms+ba1.5mg·l-1+naa0.2mg·l-1能显著诱导带芽愈伤组织。
在上述高轮环藤宁和千金藤素含量的地不容组培繁育方法，其中，步骤3)所述不定芽分化培养基配方为ms+ba0.5mg·l-1+naa0.2mg·l-1，所述芽尖0.5～1cm，该芽尖能显著提高生根能力。
在上述高轮环藤宁和千金藤素含量的地不容组培繁育方法，其中，步骤4)所述生根培养基配方为1/2ms+iba0.8mg·l-1+嘧啶醇1.0～2.0mg·l-1。该方法中嘧啶醇是赤霉素抑制剂，能抑制芽增长的同时，促进根的再生，是地不容生根的决定因素之一。
所述ms、iba、ba、naa和嘧啶醇均为固体，配置溶剂为水。
其中嘧啶醇为高轮环藤宁和千金藤素含量的地不容组培生根所必须的，1.0～2.0mg·l-1的浓度范围是发明人通过实验摸索得到的，高于或低于这个浓度，这类地不容组胚芽将无法生根，或产生代愈伤的根，导致无法移栽成活。
在上述高轮环藤宁和千金藤素含量的地不容组培繁育方法，其中，步骤6)所述土壤基质为腐殖土：细河沙质量比1:1，所述灭菌处理为500倍水稀稀释多菌灵，500水稀释倍敌白虫，分别进行表面喷湿灭菌。
在上述高轮环藤宁和千金藤素含量的地不容组培繁育方法，其中，所述芽诱导培养基、愈伤诱导培养基、不定芽分化培养基和生根培养基均为灭菌后培养基，灭菌方法为121℃高压灭菌20min，灭菌前ph调至5.5-6.0。优选5.8。
在上述高轮环藤宁和千金藤素含量的地不容组培繁育方法，其中，步骤1)-5)的培养温度为25±2℃，光照强度为1600～1800lx，该温度和光照条件能显著增加组培地不容的生长。
将营养袋放入盛水的水槽中，使水反向渗透直至浸润整袋基质后，取出营养袋控水，至没有水分渗出为止，是营养袋浇透水。
在上述高轮环藤宁和千金藤素含量的地不容组培繁育方法，其中，步骤7)所述肥水及病虫害预防方法为甲霜灵锰锌喷施和多菌灵交替处理防治根部真菌病害，以2.5％氯氰菊酯喷施预防虫害，以纯氮2kg/667m2，用磷酸二氢钾和氯化钾补齐磷、钾(n:p:k3:1:3)，10天左右，按低于0.5％进行1次喷施。
在上述高轮环藤宁和千金藤素含量的地不容组培繁育方法，其中，所述的外植体灭菌、继代等过程均在无菌环境中操作。
在上述高轮环藤宁和千金藤素含量的地不容组培繁育方法，其中，所述的芽诱导、愈伤诱导、不定芽分化、生根培养基，均加琼脂5.6g·l-1，蔗糖20～30g·l-1。
所述高轮环藤宁和千金藤素含量的地不容外植体的获得方式：
地不容野外雌、雄植株采收，称取药用部分，干燥；
轮环藤宁和千金藤素测量的hplc样品准备中，取干燥药材，用95％乙醇(1g料：5ml液)事先浸泡再连续回流提取；乙醇提取液减压回收得到浸膏，所述浸膏用2％(质量百分数)的稀硫酸酸化溶解，并调ph(3-4)，用氯仿萃取2次后，回收溶剂部分；酸水溶液用浓氨水碱化，并调ph(10-11)，用氯仿再萃取2次，合并两次氯仿萃取相，调ph(6-8)后，直接或浓缩后用于hplc的分析；所述高效液相方法为色谱柱odsc18柱150mm×5mm，5μm，流动相甲醇：水(体积比为70∶30)流速1.0ml/min，检测波长为280nm。高轮环藤宁和千金藤素标准，所述要求为轮环藤宁和千金藤素含量分别大于3.5mg·g-1干重和2.4mg·g-1干重；根据这种方法获得高轮环藤宁和千金藤素的地不容带节茎段作为外植体。
本发明未写明详细实验步骤之处，均为本领域常规技术，属于本领域普通技术人员能够理解和实施的操作。
本发明地不容组培繁育方法备具有如下优点：
(1)相较于种子收集，外植体材料容易获得；
(2)保持母本优良的种质性状；
(3)繁殖系数大(扩增系数到15-20株/芽*40天)，比常规方法(扩增系数到6-8株/芽*50天)效率高2-3倍，且后代整齐一致，容易移栽成活；
(4)为建立遗传转化体系提供基础。
以下实施例对本发明做进一步的描述，但该实施例非用于限制本发明的保护范围。
具体实施方式
实施例1
1、材料：地不容雌株带节茎段
2、实验器材：超净台、营养袋10×10cm(直径×高度)、烧杯(250ml)、玻璃棒、计时器、镊子、剪刀。
3、方法：以富含轮环藤宁和千金藤素地不容雌株带节茎段为外植体，经芽诱导、愈伤诱导、不定芽诱导、生根、炼苗、移栽实现组培繁育。
4、操作步骤：
1)芽诱导，选取雌株带节嫩茎段为外植体，经过常规灭菌处理(流水冲洗30min后，75％酒精浸泡20～30s，0.2％hgcl2灭菌6～10min，无菌水漂洗3～4次，无菌滤纸吸干水分)，接种到芽诱导培养基1/2ms+ba0.5mg·l-1+iba0.1mg·l-1上；
2)愈伤诱导，当新芽长到2～3cm后剪切转接到愈伤诱导培养基ms+ba1.0mg·l-1+naa0.1mg·l-1上；
3)不定芽分化，将带芽的愈伤接到不定芽诱导分化培养基ms+ba0.8mg·l-1+naa0.2mg·l-1上，平均分化不定芽数量达14个/40d；
4)生根培养，剪切不定芽分化得到的0.5～1cm芽尖转接到生根培养基1/2ms+iba0.5mg·l-1+嘧啶醇1.0mg·l-1上，诱导率达89％；
5)炼苗，当步骤4)诱导出根6～9根，长5cm后，打开瓶盖进行炼苗3天；
6)移栽，清洗干净根上的培养基，移栽到装有土壤基质(腐殖土：河沙1:1配制)的营养袋(10×10cm，直径×高度)中，土壤基质经500倍稀释多菌灵，500稀释倍敌白虫，分别表面喷湿灭菌，浇足透水，成活率达90％以上。
7)肥水及病虫害预防管理，用甲霜灵锰锌喷施和多菌灵交替处理防治根部真菌病害，以2.5％氯氰菊酯喷施预防虫害，以纯氮2kg/667m2，用磷酸二氢钾和绿化钾补齐磷、钾(n:p:k3:1:3)10天左右1次喷施。
实施例2
1、材料：地不容雄株带节茎段
2、实验器材：超净台、营养袋10×10cm(直径×高度)、烧杯(250ml)、玻璃棒、计时器、镊子、剪刀。
3、方法：地不容雄株带节茎段为外植体，经芽诱导、愈伤诱导、不定芽诱导、生根、炼苗、移栽实现组培繁育。
4、操作步骤：
1)芽诱导，选取雄株带节嫩茎段为外植体，经过常规灭菌处理(流水冲洗30min后，75％酒精浸泡20～30s，0.2％hgcl2灭菌6～10min，无菌水漂洗3～4次，无菌滤纸吸干水分)，接种到芽诱导培养基1/2ms+ba0.2mg·l-1+iba0.1mg·l-1上；
2)愈伤诱导，当新芽长到2～3cm后剪切转接到愈伤诱导培养基ms+ba1.5mg·l-1+naa0.2mg·l-1上；
3)不定芽分化，将带芽的愈伤接到不定芽诱导分化培养基ms+ba0.6mg·l-1+naa0.2mg·l-1上，平均分化不定芽数量达12个/40d；
4)生根培养，剪切不定芽分化得到的0.5～1cm芽尖转接到生根培养基1/2ms+iba0.5mg·l-1+嘧啶醇1.5mg·l-1上，诱导率达80％；
5)炼苗，当步骤4)诱导出根6～9根，长5cm后，打开瓶盖进行炼苗3天；
6)移栽，清洗干净根上的培养基，移栽到装有土壤基质(腐殖土：河沙1:1配制)的营养袋(10×10cm，直径×高度)中，土壤基质经500倍稀释多菌灵，500稀释倍敌白虫，分别表面喷湿灭菌，浇足透水，成活率达87％。
7)肥水及病虫害预防管理，用甲霜灵锰锌喷施和多菌灵交替处理防治根部真菌病害，以2.5％氯氰菊酯喷施预防虫害，以纯氮3kg/667m2，用磷酸二氢钾和绿化钾补齐磷、钾(n:p:k3:1:3)，以小于0.5％质量浓度，10天左右1次喷施。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，应当指出的是，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改造，这些都属于本发明的保护范围，因此，本发明专利的保护范围以所附权利要求为准。