本发明属于植物组培
技术领域：
，具体涉及一种马铃薯茎段的繁殖培养基和组织培养方法。
背景技术：
：马铃薯(solanumtuberosuml.)属于茄目solanales；茄科solanaceae；茄属solanum。马铃薯(s.tuberosum)又称土豆、山药蛋、洋芋等，块茎可以食用，是世界上非常重要的一种宜粮、宜菜、宜饲、宜工业原料等多用途的经济作物，同时是世界上仅次于小麦、水稻、玉米，产量居列第四位的作物。截止到2020年，对马铃薯的需求量将增长至40％，会超过水稻、小麦、玉米的增长速度。尤其是在亚洲和非洲地区，对马铃薯的需求将增长的更快。马铃薯分布非常广泛、适用性强、产量高、营养丰富，具备鲜食和加工等多种用途。为了提高马铃薯防治病毒病的能力,避免产量与品质的下降,对其进行茎段繁殖培养可以有效提高马铃薯的产量与品质，在解决诸如粮食安全、营养不良、贫困和对环境威胁等全球焦点问题重要性上具有重要意义。植物组织培养是以植物细胞培养技术为前提的一项生物技术。它起始于20世纪30年代，经历30多年的基础研究和技术完善，与60年代形成产业化。马铃薯繁殖技术是现代生物技术中的主要研究内容之一，也是生物技术在生产中应用最早、最广泛、效果最显著的研究成果之一。早在50年代中期的时候，欧洲的一些马铃薯生产大国就开始了以茎尖分生组织培养法脱除马铃薯病毒为基础的无病毒种薯生产体系建设研究，以期通过“复壮”来恢复优良品种的种性，并保证生产种薯的质量。20世纪60年代以后，由于组织培养技术日趋成熟和完善，世界各地的植物组织培养研究和产业化应用进入迅速发展阶段，几乎所有的马铃薯生产国都使用这项技术进行脱毒快繁，并部分的进行育种研究。目前以马铃薯叶片、茎段、叶柄、根等多种外植体进行的再生植株培养，均采用多步成苗培养。具体为：将马铃薯试管苗的叶片、茎段、叶柄、根等的外植体进行愈伤组织培养，诱导30d左右后进行愈伤组织的继代培养，再将愈伤组织转接分化培养基中再生植株，多步培养途径繁琐，再生率普遍较低且诱导时间长。一步成苗方法具有再生周期短，繁殖系数和再生频率高，易操作等优点，但是，对马铃薯一步培养的培养基要求也很高。目前，现有技术中的马铃薯一步培养的培养基通常以马铃薯、葡萄糖、蔗糖、琼脂、碳酸钙、氯化钠和水为基本成分，引入马铃薯生长分化所需一系列生长调节因子和其他营养物质，对马铃薯组织培养具有一定的促进作用，但是，其促进作用有限，并不能很好的达到一步培养，快速繁殖的要求，而且，这样的培养基由于成分较多，配制的步骤较为繁琐，每个批次之间不能达到很好的均一化效果，也阻碍的一步培养的方法的产业化。另外，现有技术中也有将ms培养基中氮源改为铵态氮和硝态氮并按一定比例进行复配来获得一步培养的培养基。虽然，这样的方法获得的培养基成分简单，配制容易，但是，其培养效果，特别是对于茎段繁殖过程中生根壮苗的效果，并不理想，从而最终影响茎段繁殖的再生率。因此，获得一种培养基成分简单，配制容易且生根壮苗的效果良好的茎段繁殖培养基，并以此培养基为基础开发出再生率高，操作简便，繁殖速度快的马铃薯组织培养技术，是目前急需解决的问题。技术实现要素：本发明目的之一是提供一种茎段繁殖的培养基，其可以提高马铃薯茎段繁殖过程中生根和壮苗的效果，提高马铃薯一步繁殖的速度和再生率。为实现上述目的，本发明的所采用的马铃薯茎段繁殖培养基成分为：ms培养基、吲哚乙酸、植物凝胶、聚乙烯吡咯烷酮和蔗糖；优选的，马铃薯茎段繁殖培养基成分为：ms、0.1‐0.05mg/l的吲哚乙酸(iaa)、2‐3g/l的植物凝胶、2‐3g/l的聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、1‐2的％蔗糖；更加优选的，马铃薯茎段繁殖培养基成分为：ms、0.05mg/l的吲哚乙酸(iaa)、3g/l的植物凝胶、3g/l的聚乙烯吡咯烷酮(pvp)和1％蔗糖。在上述培养基中，ms为本领域常用的植物组织培养培养基，其成分具体为：大量元素：nh4no3，1650mg/l、kno3，1900mg/l、cacl2·2h2o，440mg/l，mgso4·7h2o，370mg/l、kh2po4170mg/l；微量元素：ki，0.83mg/l、h3bo3，6.2mg/l、mnso4·4h2o，22.3mg/l、znso4·7h2o，8.6mg/l、na2moo4·2h2o，0.25mg/l、cuso4·5h2o，0.025mg/l、cocl2·6h2o，0.025mg/l；铁盐：feso4·7h2o(27.8mg/l)、na2‐edta·2h2o(37.3mg/l)；有机物质：肌醇，100mg/l、烟酸，0.5mg/l、盐酸吡哆醇(维生素b6)，0.5mg/l、盐酸硫胺素(维生素b1)，0.1mg/l、甘氨酸，2.0mg/l。本发明中所使用的ms为商业制造的ms培养基粉末，使用时直接称量溶解即可。本发明的ms培养基中不含有植物激素类物质和糖类物质。吲哚乙酸是一种有机物。纯品是无色叶状晶体或结晶性粉末，其通常作为植物生长激素，调节植物的生长，促进植物生根生芽。聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)简称pvp，是一种非离子型高分子化合物，是n‐乙烯基酰胺类聚合物中的一种，pvp作为一种合成水溶性高分子化合物，具有水溶性高分子化合物的一般性质，胶体保护作用、成膜性、粘结性、吸湿性、增溶或凝聚作用，其广泛的应用于医药卫生、食品加工领域。在本发明的培养基中，所述的植物凝胶是gelzan胶，具体的为g3251(phytotechlab公司生产的一种植物凝胶，cas:71010‐52‐1)。g3251是众多gelzan胶中的一种，其是由微生物发酵而来，g3251与同类的gelzan胶产品相比具有用量少(0.25％的使用量就可以达到琼脂1.5％使用量的凝胶强度)，凝固点、熔点和弹性、硬度都可以调节，产品差异小，与营养附加物的良好兼容、热稳定性好且耐酸等优良的特性。本发明另外一个目的是提供一种茎段繁殖的培养基的制备方法，具体步骤如下：称取ms培养基粉4.43g(根据说明书提供的用量)，3g的pvp粉末，10g的蔗糖，加适量蒸馏水溶解，移液枪吸取50ul的1mg/liaa加入到溶液中，然后加入蒸馏水定容到1升(l)，用1mg/ml氢氧化钠(naoh)调节ph至5.8，称取3g的g3251粉末，微波炉中高火加热至g3251充分溶解(一般1l需加热7‐8分钟)。本发明的第三个目的是提供一种马铃薯茎段繁殖的方法，其采用本发明所述的茎段繁殖培养基，实现了只用一种培养基，一步繁殖培养且能够获得良好再生率的效果。所述马铃薯茎段繁殖的方法的具体方法为：(1).生根培养：取马铃薯无菌苗,用镊子夹取茎段放置于接种碟上，手术刀切取茎段2‐5cm，至少2个节点，放置于灭菌后的生根培养基中，至少一个节点扦插入培养基中，进行诱导生根培养。培养条件：温度24‐26℃，光照强度：3000‐5000lx，光照时间16h/d，在光照培养箱中无菌培养5‐6周。所述的生根培养基成分为：ms、0.05mg/l吲哚乙酸(iaa)、3g/lg3251、3g/lpvp(聚乙烯吡咯烷酮)、1％蔗糖，ph调至5.8。(2).炼苗：当经过生根培养后的生根试管苗高7‐10cm时,将组培苗进行室内炼苗,炼苗温度为26‐28℃,光照强度5000‐10000lx，光照时间15‐17h/d,室内敞口炼苗3‐5天。(3).移栽：取出试管苗，连培养基一起移栽到用多菌灵灭菌过的土壤+蛭石按照1:1的比例做基质的盆栽钵中，浇足水，光照强度：5000‐10000lx，光照时间16h/d，2周后室外培养，保证水分即可。与现有技术相比，本发明具有以下优点：1、本发明的培养基在ms培养基的基础上，仅加入了吲哚乙酸(iaa)、g3251、pvp(聚乙烯吡咯烷酮)、蔗糖，培养基成分简单，易于配制，培养基的均一化程度高，易于产业化操作。通过ms、吲哚乙酸(iaa)、g3251、pvp(聚乙烯吡咯烷酮)、蔗糖的合适配比，使马铃薯茎段在本发明的培养基上获得良好的生根壮苗效果，适用后续的一步培养繁殖方式。2、本发明基于合适的培养基，采用了一步培养繁殖方式进行马铃薯茎段的繁殖，操作简单，幼苗移栽后成活率达到97％以上，获得幼苗的周期缩短为2个月以内。3、采用结冷胶g3251(gelzan胶)代替传统琼脂。g3251结冷胶具有较传统琼脂更高的透明度，本实验中便于观察茎段的生根情况；其能够更好的兼容各种营养物质，促进根部生长，凝胶的弹性更好，根部的生长阻碍小，有更好的生根壮苗效果。4、本发明将培养基与组培苗一起直接移栽到用多菌灵灭菌过的土壤：蛭石按照1:1的比例做基质的盆栽钵中。蛭石具有很好的保水性，可以保证充足的水分。培养基与组培苗一起移栽，幼苗更健壮，成活率更高。附图说明图1是切取茎段2-5cm，培养10天后的组培苗生长情况；图2是切取茎段2-5cm，培养4周后的组培苗生长情况；图3是移栽室内2周后的生长情况；图4是将室内的苗移栽至室外4周后的生长情况；图5是g3251与普通琼脂的对比；图6是切取茎段2-5cm，在琼脂培养基中培养10天后组培苗的生长情况。具体实施方式为了更好的理解本发明的技术方案，下面结合实施例详细描述本发明提供的技术方案。实施例1马铃薯茎段繁殖培养基的配制和不同成分培养基生根壮苗效果比较马铃薯茎段繁殖培养基，培养基配方为：ms培养基、0.05mg/l的吲哚乙酸(iaa)、3g/l的g3251、3g/l的聚乙烯吡咯烷酮(pvp)和1％蔗糖。培养基的配置方法为：称取ms培养基粉4.43g(根据说明书提供的用量)，3g的pvp粉末，10g的蔗糖，加适量蒸馏水溶解，移液枪吸取50ul的1mg/liaa加入到溶液中，然后加入蒸馏水定容到1升(l)，用1mg/ml氢氧化钠(naoh)调节ph至5.8，称取3g的g3251粉末，微波炉中高火加热至g3251充分溶解(一般1l需加热7-8分钟)。将配制好的培养进行分装，备用。为了比较不同培养基成分对马铃薯茎段繁殖过程中，生根壮苗效果的影响，根据上述培养基配制的方法，结合本领域常规的配制技术，对培养基成分进行调整，获得以下不同成分组成的培养基：培养基1：1/2ms、naa1mg/l、8g/l琼脂糖；培养基2：ms、naa1mg/l、8g/l琼脂糖；培养基3：ms、0.05mg/l吲哚乙酸(iaa)、3g/lg3251、3g/l的聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、1％蔗糖；培养基4：ms、0.1mg/l吲哚乙酸(iaa)、3g/lg3251、3g/l的聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、1％蔗糖；培养基5：ms、0.05mg/l吲哚乙酸(iaa)、3g/lg3251、3g/l的聚乙烯吡咯烷酮(pvp)；培养基6：ms、0.05mg/l吲哚乙酸(iaa)、8g/l琼脂糖、3g/l的聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、1％蔗糖；培养基7：ms、0.5mg/lnaa、8g/l琼脂糖、1％蔗糖。取马铃薯无菌苗,用镊子夹取茎段放置于接种碟上，手术刀切取茎段2-5cm，至少含有2个节点，分别放置于灭菌后的培养基1-7中，至少一个节点扦插入培养基中，进行诱导生根培养。培养条件：温度24-26℃，光照强度：3000-5000lx，光照时间16h/d，在光照培养箱中无菌培养10天。培养结果如表1所示。表1不同的培养基成分对马铃薯生根壮苗效果的影响从表1的结果中可以看出，采用ms或者1/2ms、naa、琼脂糖的培养基进行繁殖，虽然具有一定的生根数量，但是根的长度普遍较短，而采用ms、吲哚乙酸(iaa)、g3251、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖无论是在生根的数目、根长度都有较为良好的效果，特别是培养基3：ms、0.05mg/l吲哚乙酸(iaa)、3g/lg3251、3g/l的聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、1％蔗糖，在培养第10天后，能够获得生根数目5-8根，根长度大于10cm的优异效果(如图1所示)，这对于后续的获得良好的繁殖效果，打下了优良的基础。另外，通过比较g3251和琼脂糖的生根效果可以看出，采用g3251的培养基无论是在根的数目还是根的长度上，都比琼脂糖有更好效果，这说明g3251有着更好的营养物质兼容性、凝胶的弹性更好，根部的生长阻碍小，能够更好的促进根部的繁育与生长。实施例2：马铃薯的茎段繁殖的方法生根培养：取培养30天的无菌苗,用镊子夹取茎段放置于接种碟上，手术刀切取茎段2-5cm，至少2个节点，共切取茎段数量36根，放置于灭菌后的生根培养基中，一个节点扦插入培养基中，诱导生根。生根培养基的配方为:ms、吲哚乙酸(iaa)0.05mg/l、3g/lg3251、3g/lpvp、1％蔗糖，ph＝5.8。培养条件：温度24℃，光照强度：3000-5000lx，光照时间16h/d，在光照培养箱中无菌培养。培养4周。炼苗：当生根培养基中的试管苗高7-10cm时,将组培苗进行室内炼苗,炼苗温度为26℃,光照强度5000-10000lx，光照时间15-17h/d,室内敞口炼苗3天。移栽：取出试管苗，连培养基一起移栽到用多菌灵灭菌过的土壤+蛭石按照1:1的比例做基质的盆栽钵中，浇足水，光照强度：5000-10000lx，光照时间16h/d，2周后室外培养，保证水分即可。实施例3：以实施例2生根培养获得组培苗再次进行茎段繁殖的方法取实施例2生根培养后扩增繁殖的无菌苗,用镊子夹取茎段放置于接种碟上，手术刀切取茎段2-5cm，至少2个节点，共切取茎段数量52根放置于灭菌后的生根培养基中，一个节点扦插入培养基中，诱导生根。生根培养基的配方为:ms、吲哚乙酸(iaa)0.05mg/l、3g/lg3251、3g/lpvp、1％蔗糖，ph＝5.8。培养条件：温度24℃，光照强度：3000-5000lx，光照时间16h/d，在光照培养箱中无菌培养。培养5周。2.炼苗：当生根培养基中的试管苗高7-10cm时,将组培苗进行室内炼苗,炼苗温度为27℃,光照强度5000-10000lx，光照时间15-17h/d,室内敞口炼苗5天。3.移栽：取出试管苗，连培养基一起移栽到用多菌灵灭菌过的土壤+蛭石按照1:1的比例做基质的盆栽钵中，浇足水，光照强度：5000-10000lx，光照时间16h/d，2周后室外培养，保证水分即可。实施例4：马铃薯茎段繁殖的方法生根培养：取培养30天的无菌苗,用镊子夹取茎段放置于接种碟上，手术刀切取茎段2-5cm，至少2个节点，共切取茎段数量40根，放置于灭菌后的生根培养基中，一个节点扦插入培养基中，诱导生根。生根培养基的配方为:ms、吲哚乙酸(iaa)0.05mg/l、3g/lg3251、3g/lpvp、1％蔗糖，ph＝5.8。培养条件：温度24℃，光照强度：3000-5000lx，光照时间16h/d，在光照培养箱中无菌培养。培养5周。炼苗：当生根培养基中的试管苗高7-10cm时,将组培苗进行室内炼苗,炼苗温度为28℃,光照强度5000-10000lx，光照时间17h/d,室内敞口炼苗5天。移栽：取出试管苗，连培养基一起移栽到用多菌灵灭菌过的土壤+蛭石按照1:1的比例做基质的盆栽钵中，浇足水，光照强度：5000-10000lx，光照时间16h/d，2周后室外培养，保证水分即可。实施例2-4中所有马铃薯试管苗室外移栽地点均为湖北省武汉市洪山区，移栽在时间为9-12月。实施例2-4中马铃薯茎段繁殖的方法的具体实验结果如表2所示。表2马铃薯茎段繁殖的方法的具体实验结果茎段数量(个)生根率移栽成活率实例23680.56％96.55％实例35290.38％95.74％实例44095.00％97.37％由上表可以看出，本发明的马铃薯茎段培养基能够很好的满足一步法进行马铃薯繁殖培养的要求，即仅采用本发明的马铃薯茎段繁殖培养基，而不采用任何其他类型培养基的情况下，可以达到生根率95.00％、移栽成活率(再生率)高达97.37％的优异效果。同时，从实施例3所显示的结果中可以看出，将生根培养阶段扩增繁殖的无菌苗再次切取，并进行生根培养，仍然可以达到生根率90.38％、移栽成活率(再生率)95.74％的优异效果，该方法可以使马铃薯的繁殖系数增大4-5倍，极大的提高了马铃薯茎段繁殖的效率。另外，将培养基与组培苗一起直接移栽到用多菌灵灭菌过的土壤+蛭石按照1:1的比例做基质的盆栽钵中，幼苗更健壮，成活率更高，这样的效果也能在实施例2-4的具体实验数据中得以体现。上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。当前第1页12