本发明属于灰茶尺蛾防治方法技术领域，具体涉及一种利用内共生菌wolbachia的生殖调控作用对灰茶尺蛾进行遗传防治的方法。
背景技术
灰茶尺蛾是我国最为重要的一种茶树害虫，主要分布于福建、湖南、湖北、江西、安徽、河南、浙江、江苏等产茶省份。灰茶尺蛾一年发生6～7代，主要通过幼虫取食茶树叶片进行为害，严重发生时会将整片茶园叶片全部吃光，常给茶叶生产造成重大的经济损。目前有多种关于灰茶尺蛾的防治方法，其中最主要还是化学防治。由于常年多次喷施化学农药和不合理使用化学农药，害虫的抗药性增强，大量天敌被杀伤，导致了害虫反复爆发。同时，带来了严重的农药残留问题。近年来生物防治方法的引入一定程度避免了农残问题，但从防治效果来说也存在局限性。例如，在使用eonpv病毒防治茶尺蠖过程中发现，eonpv病毒防治小茶尺蠖具有效果良好；但防治灰茶尺蛾效果并不理想。茶是一种冲泡饮品，近年来，消费者越来越关注茶叶的安全和健康问题。另外，茶叶农残超标问题也直接影响到了中国茶叶走向世界的步伐。因此，一种安全、有效、无公害的灰茶尺蛾防治方法在生产中有迫切的需求。
本发明是利用了内共菌wolbachia能够调节昆虫生殖作用的原理，人工建立了不携带wolbachia的灰茶尺蛾纯化品系，在野外释放不携带wolbachia的雌性群体与携带wolbachia的野生灰茶尺蛾种群进行交配，交配后代卵孵化率降低从而实现对灰茶尺蛾的遗传防治。
技术实现要素：
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种利用内共生菌wolbachia的生殖调控作用对灰茶尺蛾进行遗传防治的方法的技术方案。该方法对环境、对茶叶质量安全，并且防治效果良好。
所述的一种利用内共生菌wolbachia的生殖调控作用对灰茶尺蛾进行遗传防治的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）防治对象鉴定：采集在防治地块茶尺蠖幼虫，使用coi分子标记对其种类进行分子鉴定，明确该地茶尺蠖种类为灰茶尺蛾后进行后续操作；
（2）防治地块灰茶尺蛾发生量和发生期的预测：在灰茶尺蛾的2龄幼虫期，确定每亩茶园的幼虫数量，再根据2龄幼虫至蛹的理论存活率，成虫的理论存活率，确定每亩茶园蛹或成虫的数量，同时，根据常规历期推算，确定蛹和成虫的发生期；
（3）不携带wolbachia的灰茶尺蛾纯化品系建立：采集灰茶尺蛾2龄幼虫带回养虫室进行人工饲养，使用抗生素对灰茶尺蛾的wolbachia去除效果进行筛选，待灰茶尺蛾羽化后使用wsp分子标记检测是否携带wolbachia共生菌；
（4）蛹或成虫的释放：在防治地块灰茶尺蛾的蛹期，使用养虫室饲养的不携带wolbachia共生菌的灰茶尺蛾种群，按照防治地灰茶尺蛾种群数量：释放种群数量=1：0.5～1的比例，将步骤（3）饲养的不携带wolbachia的雌性灰茶尺蛾蛹释放到防治地块中；也可在成虫期，按上述同样的比例，将饲养的雌性成虫释放到防治地块中。
所述的一种利用内共生菌wolbachia的生殖调控作用对灰茶尺蛾进行遗传防治的方法，其特征在于所述的步骤2）中采用5点取样法，每点取1米长茶行，检查茶丛表层的幼虫数量，根据1米长茶行面积为1.5m2，1亩茶园面积为667m2，确定每亩茶园的幼虫数量。
所述的一种利用内共生菌wolbachia的生殖调控作用对灰茶尺蛾进行遗传防治的方法，其特征在于所述的步骤2）中2龄幼虫至蛹的理论存活率为50%，成虫的理论存活率为40%，确定每亩茶园蛹或成虫的数量。
所述的一种利用内共生菌wolbachia的生殖调控作用对灰茶尺蛾进行遗传防治的方法，其特征在于所述的步骤3）中使用四环素或利福平对灰茶尺蛾wolbachia去除效果进行筛选。
所述的一种利用内共生菌wolbachia的生殖调控作用对灰茶尺蛾进行遗传防治的方法，其特征在于所述的步骤3）中抗生素对灰茶尺蛾wolbachia去除效果的筛选具体为：从田间剪取茶枝，将茶枝使用抗生素溶液浸泡处理后，成束插在盛水的500ml广口瓶中，待叶片上抗生素风干后，将事先从田间采集的茶尺蠖幼虫接在茶枝上饲养；按照此方法，每天更换新鲜的茶枝；连续处理两代，得到不携带wolbachia的灰茶尺蛾。
本发明利用共生菌wolbachia对灰茶尺蛾的生殖调控来降低灰茶尺蛾卵孵化率从而达到控制灰茶尺蛾发生量的一种遗传防治方法。申请人对全国10个灰茶尺蛾地理种群进行了wolbachia检测，结果显示，所有灰茶尺蛾均携带wolbachia。申请人选用了三种抗生素对灰茶尺蛾wolbachia进行去除效果筛选，最终选用了四环素处理建立了不携带wolbachia的灰茶尺蛾纯化品系。申请人将携带wolbachia的野生灰茶尺蛾种群与不携带wolbachia的灰茶尺蛾纯化种群进行了交配实验，目的在于观察交配后代卵孵化情况。实验结果显示：灰茶尺蛾野生种群卵孵化率为87.5%；亲本均去除wolbachia的灰茶尺蛾卵孵化率为84%；雌性携带wolbachia的野生灰茶尺蛾与雄性不携带wolbachia的灰茶尺蛾交配后代卵孵化率为79.4%；雌性不携带wolbachia的灰茶尺蛾与雄性携带wolbachia的野生种群灰茶尺蛾交配后代卵孵化率仅为6.5%。申请人发现去除了wolbachia的雌性灰茶尺蛾与野生灰茶尺蛾交配后代卵孵化率明显下降。根据这样的实验结果，申请人认为可将不携带wolbachia的雌性灰茶尺蛾种群释放到田间，通过抢占野生雌灰茶尺蛾的交配资源和较低的卵孵化率，从而达到控制该地区灰茶尺蛾的种群数量的目的。wolbachiaz在灰茶尺蠖中属于母系遗传方式，母本不携带wolbachia，其子代均不携带，这样释放一次不携带wolbachia的雌性成虫，在后续的多代中都能起到对卵孵化率的调节作用。
本发明的防治方法属于遗传防治，也属于生物防治，对人体、茶叶安全，有利于茶叶出口创汇，有利于茶园生态的恢复，是一种安全有效的防治方法，可以丰富灰茶尺蛾的防治方法并弥补原有方法的不足。本发明方法无污染，符合病虫绿色防控原则，符合标准生态茶园的建设要求。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步描述。
实施例
（一）防治地块茶尺蠖种类鉴定
1、在防治地块使用5点取样法，采集茶尺蠖幼虫样本（样本数量不少于20头），置于无水酒精中浸泡保存，带回实验室使用分子生物学方法进行物种鉴定。首先，使用天根试剂盒提取昆虫基因组dna，以基因组dna为模板扩增coi片段序列，扩增引物为lepf1:（5'-attcaaccaatcataaagatattgg-3'）；lepr1（5'-ctccwccagcaggatcaaaa-3'）。扩增产物送擎科生物有限公司测序。测序结果经seqman5.01）拼接后，使用mega5.0软件进行比对并计算遗传距离，遗传距离小于2.5%视为灰茶尺蛾。灰茶尺蛾标准序列由genbank中下载，基因登陆号为kj704330。当明确该地茶尺蠖种类为灰茶尺蛾后进行后续防治操作。
（二）防治地块茶尺蠖的预测
2、发生量预测：在需要防治的地块中，于2龄幼虫盛发期（中期），采用5点取样法，每点取1m长茶行，检查、记载茶丛表层的幼虫数，根据1m长茶行面积为1.5m2，一亩面积为667m2，算出虫口密度。如5点（7.5m2）总虫数为70头，则每亩2龄幼虫为6225头（70/7.5×667）。一般情况下，2龄幼虫至蛹的存活率（田间）为50%，至成虫的存活率为40%。6225头×50%=3113头；6225头×40%=2490头，即该茶园中，蛹的发生量为3113头，成虫发生量为2490头。
3、发生期预测：春秋季，茶尺蠖幼虫共4龄，2、3、4龄和蛹的历期分别为4、3、5天和8.5天，2龄中期（以一半算，2天）至蛹期为10天（2＋3＋5）；至成虫期为18.5天（2＋3＋5＋8.5天）。如田间调查（2龄中期）为6月15号，则蛹期为6月25日，成虫期为7月3～4日（也为产卵期）。
（三）不携带wolbachia的灰茶尺蛾纯化品系建立
4、从灰茶尺蛾发生地采集2龄幼虫带回养虫室，采摘新鲜茶叶进行饲养。
5、使用三种抗生素（头孢氨苄、四环素、利福平）对去除灰茶尺蛾wolbachia效果进行筛选。具体方法如下：将三种抗生素配制成同浓度的溶液，将茶枝分别浸泡于三种溶液中1分钟，取出后插入500ml大口玻璃玻璃瓶中，待茶枝上溶液风干后，每个处理接入40～50头茶尺蠖幼虫进行饲养。每日更换新鲜的抗生素处理过的茶枝。续代饲养。每代成虫阶段取样检测wolbachia的携带情况。
6、wolbachia的检测方法如下：使用天根试剂盒提取基因组dna，以基因组dna做模板pcr扩增wsp基因片段，扩增引物为wsp81f：（5'-tggtccaataagygaagaaac-3'）；wsp691r：（5'-aaaaattaaacgctactcca-3'）。pcr产物进行电泳检测，有目的条带者为携带wolbachia的样本。
7、使用抗生素处理一代后，三个处理的成虫均能检测wolbachia，连续处理两代后，头孢氨苄处理wolbachia检出率为100%；而四环素和利福平处理wolbachia检出率均为0。最终选择四环素处理组作为不携带wolbachia的纯化品系。
8、将接种幼虫的玻璃瓶放在一个大塑料盆中，老熟幼虫会爬到塑料盆中化蛹，老熟幼虫化蛹后将蛹取出，解剖镜下将雌雄蛹分开，放置不同玻璃瓶中保存，每个瓶中蛹的数量30头。
9、成虫羽化时，将成虫接入500ml玻璃瓶中，每瓶1对，同时放入三层纸摺叠、钉紧、具有裂缝的纸条2条，供其产卵。
10、每天定时将有卵块的纸条取出，放入500ml玻璃瓶中，用橡皮筋、白纸扎口，盖玻璃片，放入4℃冰箱中（此时卵停止生育）。
11、在防治地块野生灰茶尺蛾的产卵期，将冰箱中的卵取出，按上述同样的方法饲养至蛹。
（三）蛹或成虫的释放
12、在蛹期，按防治地块预测总蛹数的1/2，将室内饲养的雌蛹均匀释放于田间，如防治地块一亩的蛹数为3113头，则释放雌蛹至少1557头。
13、也可在成虫期，按防治地块成虫总数（雄蛾约占1/2）的1/2，将雄蛾（成虫）分批释放于田间。如预测防治地块每亩成虫发生量为2490头，则释放室内饲养的雌蛾至少1245头。无论是释放雌蛹还是雌蛾，释放的数量越多，防治效果越好。
经过多地的防治试验统计，通过本实施例的防治效果（防治率）可达90%以上。