本发明涉及一种甜叶菊新品种，所述甜叶菊品种含有高含量的rm，并可由保藏的愈伤组织连续培育产生；涉及从该品种的甜叶菊干叶制备高rm含量甜菊糖苷的方法。
背景技术：
：甜叶菊(stevia)，学名为steviarebaudianabertoni，是一种多年生菊科草本植物，原产于南美巴拉圭，其叶片中含有甜菊糖苷，其甜度为蔗糖的150～300倍，是一种高甜度、低热能、味质好、安全无毒的新型天然甜味剂，可广泛应用于食品、饮料、医药、日化工业等行业。甜菊糖苷是多组分糖苷混合物，糖苷组分及含量决定混合物的甜度和口感。甜叶菊中的甜菊糖苷含有13种组分，即甜叶菊苷a(rebaudiosidea，简称reba或ra)、甜叶菊苷b(rebaudiosideb，简称rebb或rb)，甜叶菊苷c(rebaudiosidec，简称rebc或rc)，甜叶菊苷d(rebaudiosided，简称rebd或rd)，甜叶菊苷e(rebaudiosidee，简称rebe或re)，甜叶菊苷f(rebaudiosidef，简称rebf或rf)，甜叶菊苷m(rebaudiosidem，简称rebm或rm)，甜叶菊苷n(rebaudiosiden，简称rebn或rn)，甜叶菊苷o(rebaudiosideo，简称rebo或ro)，甜苷a(dulcosidea，简称dula或da)，甜茶苷(rubusoside，简称rub或ru)；甜菊双糖苷(steviolbioside，简称sbio或sb)，甜菊糖(stevioside，简称stev或st)；这十三种甜菊糖苷的总和成为总甜菊糖苷(totalsteviolglycosides，tsg)；其中rm相对含量较少，约占总甜菊糖苷(tsg)的0.2％。但是rm的甜度最高，约为蔗糖的300倍，而且味质最好，最接近于蔗糖的口感，不含任何不良余味，被业内人士誉为“甜菊糖苷中的黄金”，售价也是其他糖苷的3～5倍，是一种最为理想的天然甜味剂。因此，制取rm含量高的甜菊糖苷产品具有广阔的市场前景。由于rm在甜叶菊中含量低，过去，获得高纯度rm的唯一方法是反复重结晶，反复重结晶的劣势在于产品得率低，不利于成本控制；另外由于在甜叶菊中含量低，无法大规模生产，不能满足客户的需求。因此有必要开发一种高rm含量的甜叶菊新品种，以便降低高rm含量甜菊糖苷产品生产成本并保持其稳定的得率。技术实现要素：本发明提供了一种甜叶菊变种植物。在一个实施例中，变种植物为814011谱星3号，其814011谱星3号的愈伤组织由中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(cgmcc)保藏，保藏号为cgmccno.9701，其所述814011谱星3号的植物及干叶中rm/tsg大于0.08，rd/tsg大于0.08。在另一个实施例中，变种植物通过以akhl1为父本，eirete为母本进行杂交，得到f1代，并从所述f1代优选出性状优良且稳定的单株yf001，然后以yf001为父本，pcstar2为母本进行杂交，得到f2代，其中所述f2代表达由权利要求1所描述的814011谱星3号的所有生理和形态特征，其814011谱星3号的愈伤组织由中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(cgmcc)保藏，保藏号为cgmccno.9701。在另一个实施例中，变种植物或其一部分表达由权利要求1所描述的814011谱星3号所有的生理和形态特征，其814011谱星3号的愈伤组织由中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(cgmcc)保藏，保藏号为cgmccno.9701。本发明同时提供了产生甜叶菊变种植物或其一部分的愈伤组织，甜叶菊变种植物的再生细胞及其再生细胞的组织培养。本发明同时提供了产生甜叶菊变种植物的方法。在一个实施例中，所述方法包括：以akhl1为父本，eirete为母本进行杂交，得到f1代，并从所述f1代优选出性状优良且稳定的单株yf001，然后以yf001为父本，pcstar2为母本进行杂交，得到f2代，其中所述f2代表达由权利要求1所描述的814011谱星3号的所有生理和形态特征，其814011谱星3号的愈伤组织由中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(cgmcc)保藏，保藏号为cgmccno.9701。本发明同时提供了一种高rm含量甜菊糖苷的制备方法。在一个实施例中，所述制备方法包括：提供用于制备高rm含量甜菊糖苷的原料，其原料为由权利要求1-3所描述的甜叶菊植物或干叶，其植物及干叶中rm/tsg大于0.08，rd/tsg大于0.08；粉碎所述原料；用水或水溶剂提取所述粉碎原料，获得甜菊糖苷产品，其中rm/tsg大于0.08，rd/tsg大于0.08。在另一个实施例中，所述制备方法包括：提供用于制备高rm含量甜菊糖苷的甜叶菊植物或干叶，其植物及干叶中rm/tsg大于0.08，rd/tsg大于0.08；所述甜叶菊植物或干叶通过愈伤组织再生或扦插由权利要求1-3所描述的甜叶菊植物而得到；粉碎所述甜叶菊植物或干叶；用水或水溶剂提取所述粉碎甜叶菊植物或干叶，获得甜菊糖苷产品，其中rm/tsg大于0.08，rd/tsg大于0.08。本发明同时提供了一种高rm含量的甜菊糖苷产品，其中rm/tsg大于0.08，rd/tsg大于0.08。本发明同时提供了一种甜叶菊变种植物或其一部分,源自814011谱星3号的任何一代的后代，其所述814011谱星3号的愈伤组织由中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(cgmcc)保藏，保藏号为cgmccno.9701。通过如下结合附图对优选实施例的详细描述，本发明的目的和优点是显而易见的。附图说明本发明的优选实施方案现在将参考附图进行说明，其中类似的附图标记表示相同的元件。图1、杂交选育甜叶菊植物的示意图。具体实施方式1、高rm含量甜叶菊品种育种方法技术路线如图1所示。采用三交育苗方法，分别选择eirete、pcstar2为母本，先以akhl1为父本进行一次杂交，再以优选单株yf001为父本进行二次杂交，采收种子，育苗，移栽大田种植。以单株选择育种方式选择优良单株，经过种植观察其农艺性状和分析检测糖苷含量，性状稳定后，再用组织培养法和无性扦插繁殖方式固定其优良性状，经示范性种植后，成为新品种。a、选育yf001通过杂交育种的方法进行选育。首先，将母本eirete和父本akhl1种植于同一大棚中，通过蜜蜂封闭式授粉的方法进行杂交，收其母本的种子(f1代)进行播种、育苗、种植，根据农艺性状及色谱分析，从f1代中选出性状优良且稳定的单株，经无性扦插繁殖固定后的新品系，即yf001号单株。通过父本akhl1与母本eirete杂交得到的yf001，其ra、st含量明显下降，而rd、rm的含量明显增加。b、选育814011谱星3号(814011pcstar3)以yf001为父本，pcstar2为母本，同样通过蜜蜂封闭式授粉进行杂交和选择，收其母本的种子进行播种、育苗、种植，根据农艺性状及色谱分析，从f2代中选出性状优良且稳定的单株，经无性扦插繁殖固定后的新品系，即814011谱星3号(814011pcstar3)。通过父本yf001和母本pcstar2杂交得到的814011谱星3号(814011pcstar3)，其rm含量又有明显的增加。对杂交种进行检测确认的方法为薄层色谱分析和高效液相分析，分析采自所述植株814011谱星3号(814011pcstar3)的干燥叶，证实rm/tsg大于0.08，rd/tsg大于0.08。然后对选育出的优良品种814011谱星3号(814011pcstar3)进行扩繁。扩繁主要采用两种方法：愈伤组织培养和扦插，其中又以愈伤组织培养为主。甜叶菊新品种814011谱星3号(814011pcstar3)的愈伤组织由中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(cgmcc)保藏，保藏号为cgmccno.9701。本发明的所涉及的植物可由814011谱星3号(814011pcstar3)品种的保藏愈伤组织再生得到。2、总甜菊糖苷含量为80％的高rm含量甜菊糖苷产品的制备(a)预处理：将粉碎的814011谱星3号(814011pcstar3)甜叶菊干叶于热水中萃取，制成甜菊糖苷萃取液，萃取液经过絮凝沉淀和板框压滤两道工序后，进入下一道工序；(b)一次吸附及解吸：采用树脂吸附上述萃取液中甜菊糖苷有效成分，到树脂出甜时止；用氢氧化钠稀溶液、盐酸稀溶液、纯水洗树脂、至流出液ph值达到7时止；用乙醇溶液对树脂进行分柱解吸，得含糖苷量为78～86％的解吸液，解吸液进入下一道工序；(c)一次离子交换：解析液依次通过一次离子交换除杂后，蒸发浓缩，得到含苷量在82～88％的浓缩液，浓缩液进入下一道工序；(d)二次离子交换：将流出液再通过二次离子交换树脂进行深度除杂，浓缩得到含苷量≥80％的浓缩液，再除菌过滤，浓缩液进入下一道工序；(e)喷雾干燥：将除菌过滤后的浓缩液喷雾干燥，得到rm/tsg大于0.08，rd/tsg大于0.08，tsg≥80％的甜菊糖苷产品。如需要制备更高纯度的产品，则在步骤(c)后按以下步骤进行：(d)二次吸附提纯：用二次吸附树脂三柱串联过饱和吸附上述浓缩液除杂，得到含苷量≥95％的甜菊糖苷提纯液，提纯液进入下一道工序；(e)二次离子交换：将提纯液通过二次离子交换树脂进行深度除杂，浓缩得到含苷量≥95％的浓缩液，再经过除菌滤膜除菌过滤，浓缩液进入下一道工序；(f)喷雾干燥：将除菌过滤后的浓缩液喷雾干燥，得到rm/tsg大于0.08，rd/tsg大于0.08，tsg≥95％的甜菊糖苷产品。实施例下面结合实施例对本发明做做进一步详细描述。实施例1新品系814011谱星3号(814011pcstar3)的育种用于杂交育种的父母本性状：母本一eirete：2010年从巴拉圭引进的甜菊新品种，总甜菊糖苷(tsg)含量高(大于20％)。株高80cm，叶子成披针状，叶子边缘具有明显锯齿，颜色为浓绿色，干叶中reba含量为11.30％，st含量为10.4％，每株有6～10个分枝。父本一akhl1：2010年从巴拉圭引进的甜菊新品种，reba含量高。该品种为晚熟品种，株高51～70cm，大田种植前期生长慢，中后期生长旺盛，一茬大田生长期为135～150天。叶子颜色为淡绿色/黄绿色。亩产干叶200公斤以上。干叶中reba含量为11.5％，st含量为1.30％。母本二谱星2号(pcstar2)：谱赛科(江西)生物技术有限公司选育的甜菊新品种，ra含量高。该品种属于晚熟品种，株高80～120cm，株型直立，生长整齐，茎粗且近地面气根发达，抗性好，叶片大且厚实，一级分枝5～8个，二级分枝少而短，利于脱叶。大田种植前期生长慢，中后期旺盛。一茬大田生长期125～135天。亩产干叶220～300公斤。总甜菊糖苷(tsg)含量13％以上，其中reba含量10％以上，rm含量0.21％。父本二yf001：第一次杂交后代中性状优良且稳定的优良单株，经无性扦插繁殖固定后的新品系。分枝能力强，抗性一般，干叶产量高。其ra含量高(表1)，且rd含量也高(表1)。杂交育种过程：2011年8月中旬开始，将所选总甜菊糖苷含量高的eirete(母本)和reba糖苷含量高的akhl1(父本)移入育种大棚内，进行杂交育种。10月初，亲本现蕾之前放入蜂箱，利用蜜蜂进行封闭式授粉杂交；11月中旬开始采收杂交种子，一直采收至12月中旬。2012年初将所得种子播种于育苗大棚内，待其长到3叶1心(约10厘米)时，将种苗移植至6×8cm的育苗袋中，并放于大棚内培养，3月初浇施一次可溶性复合肥500倍液及尿素1000倍液，3月中旬气温回暖后，将种苗移栽至试验田，并对其进行田间管理等措施。2012年7月份采收植株鲜叶，并进行干燥，采用薄层色谱及高效液相色谱法分析干叶糖苷含量，选择ra糖苷含量低且有rd、rm糖苷含量的单株，即yf001。yf001及其亲本含苷量检测结果见表1：表1：yf001及其亲本检测结果：nd：notdetected(未检出)。然后在2012年8月，以yf001为父本，pcstar2(rm含量0.21％)为母本，重复以上杂交育种方法，2013年1月初将所得种子播种在谱赛科公司塑料大棚内进行育种，种子萌发后，秧苗长至3叶1心时，移植至6×8cm的育苗袋中，并放于大棚内培养，3月初浇施一次可溶性复合肥500倍液及尿素1000倍液，3月中旬气温回暖后，将种苗移栽至试验田，并对其进行田间管理等措施。2013年7月份采收植株鲜叶，并进行干燥，采用薄层色谱及高效液相色谱法分析干叶糖苷含量，选育出rm/tsg大于0.08，rd/tsg大于0.08的单株，即814011谱星3号(814011pcstar3)。814011谱星3号及其亲本含苷量检测结果见表2：表2：814011谱星3号(814011pcstar3)及其亲本含苷量检测结果nd：未检出。新品系814011谱星3号(814011pcstar3)的扩繁及栽培管理：2013年10月至2014年2月，采用愈伤组织培养法将814011谱星3号(814011pcstar3)单株扩繁到30000株。2014年2月下旬将组培苗移植至5育苗穴盘中进行炼苗；2014年3月中下旬，将炼好的种苗移栽到大田，并进行相应的田间管理。2014年4月初(移栽后10天左右)进行查苗补缺工作，2014年4月中下旬(苗高15cm左右)开始进行打顶摘心，2014年4月中下旬开始进行第一次追肥，追施的肥料为可溶性复合肥和尿素，用量为可溶性复合肥500倍液，尿素1000倍液，2014年5月份开始进行第二次追肥管理，追施的肥料为可溶性复合肥和尿素，用量为可溶性复合肥500倍液，尿素1000倍液，后期(6月份)补施磷酸二氢钾叶面肥。2014年7月初开始进行收获，收割采用人工采收，打谷机脱叶方式，然后进行晒干，并装袋保存。分析采自所述植株的干燥叶，通过高效液相色谱测定其成分。814011pcstar3与相似品种(pcstar)中甜菊糖苷含量、各组分占总甜菊糖苷比例以及性状的比较见表3、表4以及表5。表3：814011pcstar3与相似品种(pcstar)中甜菊糖苷含量比较(％wt/wt,干基)nd–未检出。表4：814011pcstar3与相似品种(pcstar)中各组分占总甜菊糖苷比例比较(％)nd–未检出。表5：814011pcstar3与相似品种(pcstar)性状比较实施例2高rm含量甜菊糖苷产品的制备(a)预处理：将甜叶菊叶子与50℃软水按重量比1:15混合，制成甜菊糖苷提取液，经过絮凝沉淀和板框压滤两道工序，板框过滤后的滤液进入下一道工序；(b)一次吸附及解吸：用一次吸附树脂吸附上述萃取液中甜菊糖苷有效成分，用氢氧化钠溶液、盐酸溶液处理吸附了甜菊糖苷有效成分的树脂，纯水淋洗树脂，至流出液ph值达7时止，再用乙醇溶液进行解吸，得到含苷量84.5％的解吸液，解吸液去醇进入下一道工序；(c)一次离子交换：去醇解吸液依次通过一次离子交换除杂，蒸发浓缩得到含苷量为85.3％的一次浓缩液，浓缩液进入下一道工序；(d)二次离子交换：将浓缩液通过二次离子交换树脂进行深度除杂，经过浓缩得到含苷量为85.4％的二次离子交换液(两次离子交换处理，含量增加0.9％)，再进行除菌滤芯除菌过滤，无菌液进入下一道工序；(e)喷雾干燥：将无菌液进行喷雾干燥，得到rm/tsg大于0.08，rd/tsg大于0.08的甜菊糖苷产品，含苷量为85.4％。经高效液相色谱分析测定其成分：表6产品高效液相检测结果实施例3高rm含量甜菊糖苷产品的制备(a)预处理：将甜叶菊叶子与70℃软水按重量比1:20混合，制成甜菊糖苷提取液，经过絮凝沉淀和板框压滤两道工序，板框过滤后的滤液进入下一道工序；(b)一次吸附及解吸：用一次吸附树脂吸附上述脱盐滤液中甜菊糖苷有效成分，用氢氧化钠溶液、盐酸溶液处理吸附了甜菊糖苷有效成分的树脂，再用乙醇溶液进行解吸，得到含苷量82.6％的解吸液，解吸液去醇进入下一道工序；(c)一次离子交换：去醇解吸液依次通过一次离子交换除杂，蒸发浓缩得到含苷量为85.7％的一次浓缩液，浓缩液进入下一道工序；(d)二次吸附提纯：用二次大孔吸附树脂三柱串联吸附上述离子交换液除杂，得到含苷量为96.5％甜菊糖苷提纯液，提纯液进入下一道工序；(e)二次离子交换：通过二次离子交换树脂进行深度除杂，经过浓缩得到含苷量为96.9％的二次离子交换液，再进行除菌滤芯除菌过滤，无菌液进入下一道工序；(f)喷雾干燥：将无菌液进行喷雾干燥，得到甜菊糖苷产品。经高效液相色谱分析，产品rm/tsg大于0.08，rd/tsg大于0.08，含苷量为97.07％。表7产品高效液相检测结果本发明中所有样品，在下列条件下，通过高效液相色谱测定其成分。高效液相色谱检测：一种新的高效液相色谱方法检测甜菊糖苷。每个样品需用2种方法综合检测。方法1是用于分析rebe、rebd、rebm、rebn、rebo；方法2是用于分析reba、stev、rebf、rebc、dula、rub、rebb、sbio。所有糖苷的标准品,包括rebe、rebd、rebm、rebn、rebo均购于美国chromadex公司。检测仪器：配备二元泵、自动进样器的安捷伦1200高效液相色谱仪，dad检测器配合化学工作站软件使用。方法1仪器条件：色谱柱：安捷伦poroshell120sb-c182.7μm,4.6x150mm柱温：40℃流动相a：10mm磷酸二氢钠ph2.6:乙腈，75％:25％(v/v)流动相b：水：乙腈，50％:50％(v/v)流量：0.5ml/min进样量：5μl检测：uv210nm运行时间：25分钟过度时间：10分钟进样器温度：常温梯度程序，(％，v/v:)时间(min)a(％)b(％)0.0100014.0100014.5010025.00100方法2仪器条件：色谱柱：安捷伦poroshell120sb-c182.7μm,4.6x150mm柱温：40℃流动相：10mm磷酸二氢钠ph2.6:乙腈，68％:32％(v/v)流量：1.0ml/min进样量：5μl检测：uv210nm运行时间：20分钟进样器温度：常温当前第1页12