本发明属于植物组织培养技术领域，具体的说涉及一种三角梅脱毒组织培养方法。
背景技术：
三角梅为紫茉莉科叶子花属常绿木质大藤木植物,属观花树木中的观花灌木类,是重要的观赏花卉和优良的园林绿化植物。其身段优美,枝叶嫩绿柔芙，从初秋至翌年春末,开花时间达半年之久，作为一种新颖奇特、栽培管理粗放的花卉,深受人们的喜爱。三角梅作为花卉栽培时,常修整成灌木、小乔木状或多层宝塔状,故在日本叫“九重葛”；又因其花的苞片叶状,椭圆形或椭圆状披针形,有红、白、橙黄、紫、复色等多种颜色,万紫千红似杜鹃,故在广州称之为“勒杜鹃”；又由于它的新枝顶端通常是三朵簇生在三片苞片之中,花朵外围的苞片丽紫妖红,形似三角形,故在福建又名“三角梅”或“三角花”。植物学上叫“宝巾花”则来自它的拉丁学名的音译。香港叫“凑红”则可能由于其在春节前后开花而得名。
三角梅属植物不仅作为花卉备受关注，近年来有关三角梅其它应用价值的研究使人们对其有了新的认识。从三角梅叶片中分离得到具有类胰岛素功能的松醇对替代胰岛素治疗糖尿病以及减轻胰岛素疗法带来的副作用具有重要意义。研究还表明，三角梅叶片和根中至少含有2种抗病毒蛋白—bapi和bouganin,它们对于多种植物病毒具有不同程度的抑制作用。这些研究结果对于开发低毒高效的生物农药具有十分积极的意义。三角梅还是研究甜菜色素代谢的重要模式植物之一，其甜菜色素的种类和含量之丰富为开发安全的天然食用色素开辟了广阔的前景。这些相关研究展示了三角梅作为资源植物的多元价值，为进一步开发三角梅的观赏、医药、生物农药价值和作为天然食用色素以及发挥环境修复作用提供了充分的科学依据。
近年来,国内对于三角梅的研究主要集中在生物学特性、栽培管理、育种、扦插繁殖、绿化应用等方面。随着人们对三角梅研究的不断深入和园林绿化建设事业的快速发展，三角梅传统的繁殖方式越来越不能满足市场的需求，因为传统的繁殖方式存在繁殖速度慢，增殖系数小，生根时间长、繁殖时间受限制等弊端；而且随着三角梅育种研究工作的进展，人们培育出了许多观赏价值更高的新品种，有些新品种用传统的繁殖方法繁殖比较困难，难以在短时间内提供大量优良品种或株系的苗木，从而影响了三角梅的扩大繁殖和市场占有份额。
技术实现要素：
本发明的目的是为克服上述三角梅组织培养的缺陷，对三角梅的脱毒组织培养方法进行系统的研究，经过大量实验，得到一种操作简便、提高三角梅产量与品质的培养方法。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
一种三角梅脱毒组织培养方法，包括：
(1)选材：整枝选取1~2年生无腐无病害、健壮三角梅枝条；
(2)催芽：将选取好的三角梅枝条插在带水的瓶中，置于光照室内，维持温度25~30℃，光照强度3000~5000lux，光照时间24h，照射5~10d，选取3~7cm三角梅芽体小段；
(3)表面处理：将收集好的三角梅芽体小段采用流水冲洗干净，用2%吐温-80清洗10~15min，采用流水冲洗干净；
(4)消毒：采用75%酒精浸泡、0.1%hgcl溶液消毒5~10min，无菌水冲洗干净；
(5)切割：将消毒好的三角梅芽体小段切口进行更新处理，保留2~3cm；
(6)初代培养：将处理好的三角梅小段接种至培养基ⅰ上，放置于温度25~28℃、每天光照18~22h、光照强度为1000~3000lux、培养40~50d；
(7)增殖继代：选取步骤（6）中得到的无菌苗将其接种到培养基ⅱ上进行增殖培养，培养条件为：温度25~28℃、每天光照10~14h、光照强度为5000~7000lux、培养25~35d；重复上述增殖过程；
(8)生根：选取长势健壮的三角梅苗，将其接种至培养基ⅲ中，放置于温度25~28℃、每天光照12~16h、光照强度为5000~7000lux的环境中，培养20~30d；
(9)驯化炼苗：将步骤(8)得到的根系发达的三角梅苗转移到小温棚中进行驯化，遮荫，保持小温棚中温度为15~30℃，湿度控制在85~95%，7d后湿度递减至80%，此后逐步递减，15d后将三角梅苗从组织培养基中去除，将根部的培养基清洗干净，种植到基质土中；
其中：培养基ⅰ为ms改良培养基中添加0.5~1.5mg/liba、1.0~3.0mg/lzt、25~35g/l蔗糖和2~5g/l琼脂；
培养基ⅱ为ms改良培养基中添加4~5mg/lzt、0.01~0.5mg/liaa、0.1~1mg/lnaa、25~35g/l蔗糖和2~5g/l琼脂；
培养基ⅲ为ms改良培养基中添加0.1~1mg/lnaa、0.1~0.5mg/liba、15~25g/l蔗糖和2~5g/l琼脂。
作为优化的，一种三角梅脱毒组织培养方法，包括：
(1)选材：整枝选取1~2年生无腐无病害、健壮三角梅枝条；
(2)催芽：将选取好的三角梅枝条插在带水的瓶中，置于光照室内，维持温度25~30℃，光照强度4000~5000lux，光照时间24h，照射7d，选取4~6cm三角梅芽体小段；
(3)表面处理：将收集好的三角梅芽体小段采用流水冲洗干净，用2%吐温-80清洗10~15min，采用流水冲洗干净；
(4)消毒：采用75%酒精浸泡、0.1%hgcl溶液消毒5~10min，无菌水冲洗干净；
(5)切割：将消毒好的三角梅芽体小段切口进行更新处理，保留2~3cm；
(6)初代培养：将处理好的三角梅小段接种至培养基ⅰ上，放置于温度25~26℃、每天光照20h、光照强度为2000lux、培养45~50d；
(7)增殖继代：选取步骤（6）中得到的无菌苗将其接种到培养基ⅱ上进行增殖培养，培养条件为：温度25~26℃、每天光照12h、光照强度为5000~7000lux、培养25~30d；重复上述增殖过程；
(8)生根：选取长势健壮三角梅无菌苗，将其接种至培养基ⅲ中，放置于温度25~26℃、每天光照14h、光照强度为5000~7000lux的环境中，培养25~30d；
(9)驯化炼苗：将步骤(8)得到的根系发达的三角梅苗转移到小温棚中进行驯化，遮荫，保持小温棚中温度为20~30℃，湿度控制在85~95%，7d后湿度递减至80%，此后逐步递减，15d后将三角梅苗从组织培养基中去除，将根部的培养基清洗干净，种植到基质土中；
作为优化的，培养基ⅰ为ms改良培养基中添加0.5~1.5mg/liba、1.0~3.0mg/lzt、25~35g/l蔗糖和2~5g/l琼脂。
作为优化的，培养基ⅱ为ms改良培养基中添加4~5mg/lzt、0.01~0.5mg/liaa、0.1~1mg/lnaa、25~35g/l蔗糖和2~5g/l琼脂。
作为优化的，培养基ⅲ为ms改良培养基中添加0.1~1mg/lnaa、0.1~0.5mg/liba、15~25g/l蔗糖和2~5g/l琼脂。
作为优化的，所述培养基ⅰ、培养基ⅱ和培养基ⅱ的ph均被调节至5.8。
作为优化的，所述步骤(4)中酒精消毒时间不超过1min。
作为优化的，所述步骤（9）中驯化炼苗环节阴天条件下进行人工补光，补光强度为3000~5000lux。
作为优化的，所述步骤（9）中驯化炼苗步骤，转移至小温棚10~15天后每天傍晚或清晨通风半小时。
ms培养基是murashige和skoog于1962年为烟草细胞培养设计的，其特点是无机盐和离子浓度较高，是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量高，其养分的数量和比例合适，能满足植物细胞的营养和生理需要，因而适用范围比较广，多数植物组织培养快速繁殖用它作为培养基的基本培养基。ms改良培养基是在ms培养基的基础上去掉肌醇，硝酸铵减半，增加抗坏血酸10mg/l。
吲哚乙酸(iaa)：一种植物体内普遍存在的内源生长素，属吲哚类化合物，又名茁长素、生长素、异生长素，是一种有机物，对可见光稳定，对植物生长具有两重性，植物不同部位对其敏感度不同，一般根大于茎，不同植物对其敏感程度也不同。
吲哚丁酸（iba）：植物生长调节剂，用于细胞分裂和细胞增生，促进草本和木本植物的根的分生。
萘乙酸(naa)：是促进植物根系生长的植物生长调节剂，也是萘乙酰胺的中间体。萘乙酸用作植物生长调节剂，具有促进细胞分裂与扩大，诱导形成不定根，增加坐果，防止落果等，可随营养流输导到作用部位。
玉米素（zt），是一种细胞分裂素，属六大天然植物激素即生长素、赤霉素、细胞分裂素、脱落酸、乙烯和芸苔素内酯之一，因首次从甜玉米中分离到一种类似物而命名为玉米素，它的生理功能比较复杂，包括促进植物细胞分裂，阻止叶绿素和蛋白质降解，减慢呼吸作用，保持细胞活力，延缓植株衰老等。
琼脂：琼脂的最有用特性是它的凝点和熔点之间的温度相差很大。它在水中需加热至95℃时才开始熔化，熔化后的溶液温度需降到40℃时才开始凝固，所以它是配制固体培养基的最好凝固剂。用琼脂配制的固体培养基，可用以进行高温培养而不熔化，在凝固之前接种时，也不致将培养物烫死。因此，琼脂是制备各种生物培养基中应用最广泛的一种凝固剂。
蔗糖：蔗糖除供能之外，还能诱导愈伤组织组织的再分化；培养基高温灭菌时，蔗糖更稳定且不容易碳化；植物细胞中含有蔗糖转化酶，蔗糖能更好地维持培养基内的低渗环境，蔗糖形成的渗透压可较长时间地保持相对稳定，可在一定程度上减少微生物的污染。
本发明的有益效果是：
1.三角梅通过组织培养，可以起到脱毒、快繁、种质资源保存、品质改良的作用，大幅度提高了三角梅质量和品质，扩大了三角梅的种植规模。
2．确定了组织培养中控制分化、继代生长、生根等的培养基成分，研究确定了生长调节物质的种类、浓度以及培养条件的最佳优化选择，攻克了三角梅组织培养过程中的技术壁垒，达到很好的培养效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明的初代培养步骤三角梅示意图；
图2为本发明增殖继代步骤三角梅示意图；
图3为本发明生根步骤三角梅示意图。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件，除非特别说明，比例和百分比基于重量。
本发明实施例所用原料均为市售，所述实施例中培养基ⅰ、培养基ⅱ和培养基ⅱ的ph均被调节至5.8。
实施例1，一种三角梅脱毒组织培养方法，包括：
(1)选材：整枝选取1~2年生无腐无病害、健壮三角梅枝条；
(2)催芽：将选取好的三角梅枝条插在带水的瓶中，置于光照室内，维持温度28~30℃，光照强度3000lux，光照时间24h，照射7d，选取3~7cm三角梅芽体小段；
(3)表面处理：将收集好的三角梅芽体小段采用流水冲洗干净，用2%吐温-80清洗10~15min，采用流水冲洗干净；
(4)消毒：采用75%酒精浸泡55s、0.1%hgcl溶液消毒5min，无菌水冲洗干净；
(5)切割：将消毒好的三角梅芽体小段切口进行更新处理，保留2~3cm；
(6)初代培养：将处理好的三角梅小段接种至培养基ⅰ上，放置于温度26~27℃、每天光照22h、光照强度为1000lux、培养45d；培养基ⅰ为ms改良培养基中添加0.5mg/liba、2.0mg/lzt、35g/l蔗糖和2g/l琼脂；
(7)增殖继代：选取步骤（6）中得到的无菌苗将其接种到培养基ⅱ上进行增殖培养，培养条件为：温度27~28℃、每天光照10h、光照强度为6000lux、培养35d；重复上述增殖过程；培养基ⅱ为ms改良培养基中添加4.5mg/lzt、0.5mg/liaa、0.1mg/lnaa、30g/l蔗糖和5g/l琼脂；
(8)生根：选取长势健壮三角梅无菌苗，将其接种至培养基ⅲ中，放置于温度25~26℃、每天光照14h、光照强度为7000lux的环境中，培养20d；培养基ⅲ为ms改良培养基中添加0.1mg/lnaa、0.2mg/liba、25g/l蔗糖和2g/l琼脂。根系发达的三角梅无菌苗，根的条数为7~8条，长度为10~20min，方便附着在基质土中，避免伤根。
(9)驯化炼苗：将步骤(8)得到的根系发达的三角梅苗转移到小温棚中进行驯化，遮荫，保持小温棚中温度为20~25℃，湿度控制在85~95%，7d后湿度递减至80%，此后逐步递减，转移至小温棚10~15天后每天傍晚或清晨通风半小时，15d后将三角梅苗从组织培养基中去除，将根部的培养基清洗干净，种植到基质土中；阴天条件下进行人工补光，补光强度为3000lux。
经过此三角梅脱毒组织培养方法得到的三角梅苗成活率在99%以上，三角梅产量和品质都有大幅度的提高。
实施例2一种三角梅脱毒组织培养方法，包括：
(1)选材：整枝选取1~2年生无腐无病害、健壮三角梅枝条；
(2)催芽：将选取好的三角梅枝条插在带水的瓶中，置于光照室内，维持温度26~28℃，光照强度5000lux，光照时间24h，照射5d，选取3~7cm三角梅芽体小段；
(3)表面处理：将收集好的三角梅芽体小段采用流水冲洗干净，用2%吐温-80清洗10~15min，采用流水冲洗干净；
(4)消毒：采用75%酒精浸泡55s、0.1%hgcl溶液消毒10min，无菌水冲洗干净；
(5)切割：将消毒好的三角梅芽体小段切口进行更新处理，保留2~3cm；
(6)初代培养：将处理好的三角梅小段接种至培养基ⅰ上，放置于温度25~26℃、每天光照20h、光照强度为3000lux、培养40d；培养基ⅰ为ms改良培养基中添加1.5mg/liba、1.0mg/lzt、30g/l蔗糖和5g/l琼脂；
(7)增殖继代：选取步骤（6）中得到的无菌苗将其接种到培养基ⅱ上进行增殖培养，培养条件为：温度26~27℃、每天光照14h、光照强度为5000lux、培养30d；重复上述增殖过程；培养基ⅱ为ms改良培养基中添加4mg/lzt、0.3mg/liaa、1mg/lnaa、25g/l蔗糖和3.5g/l琼脂；
(8)生根：选取长势健壮三角梅无菌苗，将其接种至培养基ⅲ中，放置于温度27~28℃、每天光照12h、光照强度为6000lux的环境中，培养30d；培养基ⅲ为ms改良培养基中添加1mg/lnaa、0.1mg/liba、20g/l蔗糖和5g/l琼脂。根系发达的三角梅无菌苗，根的条数为7~8条，长度为10~20min，方便附着在基质土中，避免伤根。
(9)驯化炼苗：将步骤(8)得到的根系发达的三角梅苗转移到小温棚中进行驯化，遮荫，保持小温棚中温度为15~20℃，湿度控制在85~90%，7d后湿度递减至80%，此后逐步递减，转移至小温棚10~15天后每天傍晚或清晨通风半小时，15d后将三角梅苗从组织培养基中去除，将根部的培养基清洗干净，种植到基质土中；阴天条件下进行人工补光，补光强度为4000lux。
经过此三角梅脱毒组织培养方法得到的三角梅苗成活率在99%以上，三角梅产量和品质都有大幅度的提高。
实施例3一种三角梅脱毒组织培养方法，包括：
(1)选材：整枝选取1~2年生无腐无病害、健壮三角梅枝条；
(2)催芽：将选取好的三角梅枝条插在带水的瓶中，置于光照室内，维持温度25~26℃，光照强度4000lux，光照时间24h，照射10d，选取3~7cm三角梅芽体小段；
(3)表面处理：将收集好的三角梅芽体小段采用流水冲洗干净，用2%吐温-80清洗10~15min，采用流水冲洗干净；
(4)消毒：采用75%酒精浸泡55s、0.1%hgcl溶液消毒10min，无菌水冲洗干净；
(5)切割：将消毒好的三角梅芽体小段切口进行更新处理，保留2~3cm；
(6)初代培养：将处理好的三角梅小段接种至培养基ⅰ上，放置于温度27~28℃、每天光照18h、光照强度为2000lux、培养50d；培养基ⅰ为ms改良培养基中添加1.0mg/liba、3.0mg/lzt、25g/l蔗糖和3.5g/l琼脂；
(7)增殖继代：选取步骤（6）中得到的无菌苗将其接种到培养基ⅱ上进行增殖培养，培养条件为：温度25~26℃、每天光照12h、光照强度为7000lux、培养25d；重复上述增殖过程；培养基ⅱ为ms改良培养基中添加5mg/lzt、0.01mg/liaa、0.5mg/lnaa、35g/l蔗糖和2g/l琼脂；
(8)生根：选取长势健壮三角梅无菌苗，将其接种至培养基ⅲ中，放置于温度26~27℃、每天光照16h、光照强度为5000lux的环境中，培养25d；培养基ⅲ为ms改良培养基中添加0.5mg/lnaa、0.5mg/liba、15g/l蔗糖和3.5g/l琼脂。根系发达的三角梅无菌苗，根的条数为7~8条，长度为10~20min，方便附着在基质土中，避免伤根。
(9)驯化炼苗：将步骤(8)得到的根系发达的三角梅苗转移到小温棚中进行驯化，遮荫，保持小温棚中温度为25~30℃，湿度控制在85~95%，7d后湿度递减至80%，此后逐步递减，转移至小温棚10~15天后每天傍晚或清晨通风半小时，15d后将三角梅苗从组织培养基中去除，将根部的培养基清洗干净，种植到基质土中；阴天条件下进行人工补光，补光强度为3000lux。
经过此三角梅脱毒组织培养方法得到的三角梅苗成活率在99%以上，三角梅产量和品质都有大幅度的提高。
实施例4一种三角梅脱毒组织培养方法，包括：
(1)选材：整枝选取1~2年生无腐无病害、健壮三角梅枝条；
(2)催芽：将选取好的三角梅枝条插在带水的瓶中，置于光照室内，维持温度25~30℃，光照强度4000~5000lux，光照时间24h，照射7d，选取4~6cm三角梅芽体小段；
(3)表面处理：将收集好的三角梅芽体小段采用流水冲洗干净，用2%吐温-80清洗10~15min，采用流水冲洗干净；
(4)消毒：采用75%酒精浸泡、0.1%hgcl溶液消毒5~10min，无菌水冲洗干净；
(5)切割：将消毒好的三角梅芽体小段切口进行更新处理，保留2~3cm；
(6)初代培养：将处理好的三角梅小段接种至培养基ⅰ上，放置于温度25~26℃、每天光照20h、光照强度为2000lux、培养45d；培养基ⅰ为ms改良培养基中添加1.0mg/liba、2.0mg/lzt、30g/l蔗糖和3.5g/l琼脂。
(7)增殖继代：选取步骤（6）中得到的无菌苗将其接种到培养基ⅱ上进行增殖培养，培养条件为：温度25~26℃、每天光照12h、光照强度为5500~6000lux、培养28d；重复上述增殖过程；培养基ⅱ为ms改良培养基中添加3mg/lzt、0.1mg/liaa、0.5mg/lnaa、30g/l蔗糖和3.5g/l琼脂。
(8)生根：选取长势健壮三角梅无菌苗，将其接种至培养基ⅲ中，放置于温度25~26℃、每天光照14h、光照强度为6000~6500lux的环境中，培养28d；培养基ⅲ为ms改良培养基中添加0.5mg/lnaa、0.2mg/liba、20g/l蔗糖和3.5g/l琼脂。根系发达的三角梅无菌苗，根的条数为7~8条，长度为10~20min，方便附着在基质土中，避免伤根。
(9)驯化炼苗：将步骤(8)得到的根系发达的三角梅苗转移到小温棚中进行驯化，遮荫，保持小温棚中温度为20~28℃，湿度控制在85~95%，7d后湿度递减至80%，此后逐步递减，转移至小温棚10~15天后每天傍晚或清晨通风半小时，15d后将三角梅苗从组织培养基中去除，将根部的培养基清洗干净，种植到基质土中；阴天条件下进行人工补光，补光强度为3500~4000lux。
经过此三角梅脱毒组织培养方法得到的三角梅苗成活率在99%以上，三角梅产量和品质都有大幅度的提高。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。