一种诱导桢楠快速愈伤的方法与流程

本发明涉及园林植物生物技术中植物组织培养领域，特别涉及一种诱导桢楠快速愈伤的方法。
背景技术：
：桢楠又叫楠木、金丝楠或小叶楠等，为樟科楠属高达40余米的慢生常绿大乔木，生长缓慢，近千年的大树都未曾有衰老迹象，是国家二级重点保护树种。桢楠树皮光滑，浅灰褐色，因其生长缓慢，棱形或圆柱形绿色小枝一般较细，被灰褐色绒毛，老枝无绒毛；叶革质，嫩叶红色，老叶绿色，先端渐尖，基部楔形，叶上表面光亮无毛，下面密被短柔毛，叶脉绒毛较长，腹面中脉凹陷成沟，背面明显凸起，侧脉斜伸，背部较明显，花期4-5月，果期10-12月，核果，卵圆形。桢楠树高干直，形态优美，是理想的庭院树种和园林绿化树种，桢楠木材致密坚硬，不变形，味道清新，纹理简单大方，显有金丝，抗腐蚀、抗虫害，是用于建筑、家具、雕刻等的绝佳材料。桢楠树高干直，刚正挺拔，枝繁叶茂，绿树如荫，四季青翠，形态优美，在园林上常作为庭荫树或行道树，为我国著名观赏树种之一，常见于风景名胜区、寺庙、村舍、庭院和公园等地，有大树孤植也有与杜英、苦槠、杜仲、猴欢喜、朴树等树种形成小组团群落。与此同时，桢楠木材作为一种上佳的用材树种，深受喜爱，是大多数的人的选择，其市场需求量也在逐年增加。但是目前桢楠的繁殖方式主要还是播种和扦插，但是繁殖系数小，成活率不高，生长缓慢等远不能满足市场需求，严重影响了桢楠的开发利用。因此，很有必要建立快速诱导桢楠愈伤的方法，为以后桢楠组培快繁提供基础，加速桢楠种苗繁育以满足需求。技术实现要素：本发明针对上述问题，提供一种诱导桢楠快速愈伤的方法，以桢楠幼嫩叶片为外植体，经过外植体采集和清洁、消毒、切割和接种、暗培养以及光培养完成桢楠快速诱导愈伤。为实现以上目的，本发明采用的技术方案为：一种诱导桢楠快速愈伤的方法，包括如下步骤：(1)、外植体的采集和清洁以桢楠幼苗为母树，采集其幼嫩叶片为外植体，并清洁，备用；(2)、外植体的消毒在超净工作台内，将清洁后的外植体置于消毒剂中浸泡0.5～30min，再用0.1％的升汞溶液消毒3～10min后，用无菌水冲洗6～8次，并用无菌滤纸擦干其表面水分，备用；(3)、外植体的切割和接种将消毒后的外植体切割成大小为1cm*1cm的外植体方块，选取叶片部位带有叶缘、叶肉、叶脉或叶基部的外植体方块接种于培养基中培养；(4)、外植体的愈伤诱导培养外植体方块接种于培养基后，先在22～25℃条件下，暗培养3～7天，再转为光培养，直至诱导出愈伤，所述光培养的光照强度1500～2500lx,光照时间10～12h/d。所述培养基为：ms+ba0.05mg/l～5.0mg/l+naa0.1mg/l～5.0mg/l+葡萄籽提取物原花青素0.05g/l～0.2g/l+蔗糖20g/l～30g/l+琼脂6.5g/l～7.5g/l,ph值为5.5～6.0。所述步骤(2)中消毒剂的制备方法为：先配制浓度为2～6％的稀盐酸，再将稀盐酸采用无隔膜方式电解制得ph值为5.0～6.5，有效氯素浓度为10～30mg/l的消毒剂。所述步骤(1)中外植体采集的母树为1年生的桢楠幼苗，选用桢楠幼苗顶梢或根部萌发新长出的枝条，再从该枝条上选择生长健壮、叶色鲜艳无斑点、无病虫害的幼嫩叶片为外植体。所述步骤(1)中采集幼嫩叶片时，先向幼嫩叶片表面喷洒少许保水剂5-10min后，摘取幼嫩叶片；清洁时，将外植体浸泡在清洁液中10～20min后，清洁外植体表面，并用自来水冲洗3～4h。所述保水剂为：纯净水+naa0.1mg/l～5.0mg/l+葡萄籽提取物原花青素0.05g/l～0.2g/l。所述步骤(3)中外植体方块叶面背面朝上接种于培养基。与已有技术相比，本发明的有益效果体现在：1.外植体分别通过消毒剂和0.1％的升汞溶液消毒除菌后，外植体污染率可以控制在1％-4％，愈伤诱导率在78.2-98.1％，采用常规的75％酒精消毒，外植体污染率在9％，愈伤诱导率在63.3％；2.在培养基中加入葡萄籽提取物原花青素可以提高外植体的抗氧化能力，减少外植体的褐化，有利于诱导出健康的愈伤组织；3.采集幼嫩叶片时，向其喷洒少许保水剂，可以保持幼嫩叶片的水分和活力，防止叶片枯萎、褐化，提高愈伤诱导率；4.外植体方块叶面背面朝上接种于培养基，由于桢楠背面叶脉有突出，培养时叶脉比叶片四周切口处优先出现愈伤组织，有利于外植体愈伤诱导，加快出现愈伤，提高愈伤诱导率，同时也利于观察；5.选用1年生的桢楠幼苗顶梢或根部萌发新长出的枝条，再从该枝条上选择生长健壮、叶色鲜艳无斑点、无病虫害的幼嫩叶片为外植体，其具有较高的形态发生能力和诱导分化能力，可以加快出现愈伤，提高外植体的愈伤诱导率；本发明通过植物组织培养技术快速诱导桢楠愈伤，以桢楠幼嫩叶片为外植体，经过外植体采集和清洁、消毒、切割和接种、暗培养以及光培养完成桢楠快速愈伤，愈伤诱导率最高达到98.1％，且泛绿程度和愈伤增长量明显，为今后桢楠愈伤组织诱导，组织培养繁殖苗木，加速良种繁育，满足市场需求提供基础与相关技术支持。附图说明图1是实施例1的外植体培养图；图2是实施例2的外植体培养图；图3是实施例3的外植体培养图。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明做进一步详细叙述。实施例1(1)、外植体的采集和清洁外植体采集的母树是于2017年3月份从四川林业科学研究院引种栽植于安徽农业大学农萃园的1年生桢楠幼苗，选用根部萌发新长出的枝条，然后再从枝条上选择生长健壮、叶色鲜艳无斑点，无病虫害的幼嫩叶片为外植体，先向幼嫩叶片表面喷洒少许纯净水+naa0.1mg/l+葡萄籽提取物原花青素0.05g/l的保水剂5min后，摘取幼嫩叶片带回实验室进行外植体清洁，首先将洗衣粉和洗衣液各称取0.25g溶于250ml的水里得到清洁液，再将外植体置于清洁液中浸泡10min，然后仔细清洗外植体表面，叶片正面用手轻轻摸洗，叶片背面和叶基部用软毛刷刷洗，将其表面的尘土和部分菌体除去，然后再用流动的自来水冲洗3h，以备使用；(2)、外植体的消毒将步骤(1)处理后的外植体置于超净工作台中，超净工作台提前打开，做好台面消毒工作，使其处于鼓风状态，先用ph值为5.0，有效氯素浓度为10mg/l的消毒剂浸泡0.5min，再用0.1％升汞溶液消毒3min后用无菌水冲洗6次，再用无菌滤纸擦干表面水珠备用。(3)、外植体的切割和接种将消毒过后的外置体置于切割盘里，用灭过菌的镊子和切割刀切取外植体，叶片切成1cm*1cm的大小的外植体方块，切割成为平整切口，选取叶片部位有叶缘、叶肉、叶脉或叶基部的外植体方块，然后外植体方块叶面背面朝上接种于培养基中培养，每个培养基中接种5个外植体方块；(4)、外植体的愈伤诱导培养将外植体方块接种于ms+ba0.05mg/l+naa0.1mg/l+葡萄籽提取物原花青素0.05g/l+蔗糖20g/l+琼脂6.5g/l,ph值为5.5的培养基中，先在22℃条件下暗培养3天，然后置于每天光照10小时，光照强度为1500lx的培养室中培养，愈伤诱导效果见附图1的外植体培养图。实施例2(1)、外植体的采集和清洁外植体采集的母树是于2017年3月份从四川林业科学研究院引种栽植于安徽农业大学农萃园的1年生桢楠幼苗，选用顶梢萌发新长出的枝条，然后再从枝条上选择生长健壮、叶色鲜艳无斑点，无病虫害的幼嫩叶片为外植体，先向幼嫩叶片表面喷洒少许纯净水+naa2.5mg/l+葡萄籽提取物原花青素0.1g/l的保水剂7min后，带回实验室进行外植体清洁，首先将洗衣粉和洗衣液各称取0.25g溶于250ml的水里得到清洁液，再将外植体置于清洁液中浸泡15min，然后仔细清洗外植体表面，叶片正面用手轻轻摸洗，叶片背面和叶基部用软毛刷刷洗，将其表面的尘土和部分菌体除去，然后再用流动的自来水冲洗3.5h，以备使用；(2)、外植体的消毒将步骤(1)处理后的外植体置于超净工作台中，超净工作台提前打开，做好台面消毒工作，使其处于鼓风状态，先用ph值为5.8，有效氯素浓度为20mg/l的消毒剂浸泡15min，再用0.1％升汞溶液消毒7min后用无菌水冲洗7次，再用无菌滤纸擦干表面水珠备用；(3)、外植体的切割和接种将消毒过后的外置体置于切割盘里，用灭过菌的镊子和切割刀切取外植体，叶片切成1cm*1cm的大小的外植体方块，切割成为锯齿状切口，选取叶片部位有叶缘、叶肉、叶脉或叶基部的外植体方块，然后外植体方块叶面背面朝上接种于培养基中培养，每个培养基中接种5个外植体方块；(4)、外植体的愈伤诱导培养将外植体方块接种于ms+ba2.5mg/l+naa2.5mg/l+葡萄籽提取物原花青素0.1g/l+蔗糖25g/l+琼脂7.0g/l,ph值为5.8的培养基中，先在23℃条件下暗培养5天，然后置于每天光照11小时，光照强度为2000lx的培养室中培养，愈伤诱导效果见附图2的外植体培养图。实施例3(1)、外植体的采集和清洁外植体采集的母树是于2017年3月份从四川林业科学研究院引种栽植于安徽农业大学农萃园的1年生桢楠幼苗，选用顶梢萌发新长出的枝条，然后再从枝条上选择生长健壮、叶色鲜艳无斑点，无病虫害的幼嫩叶片为外植体，先向幼嫩叶片表面喷洒少许纯净水+naa5.0mg/l+葡萄籽提取物原花青素0.2g/l的保水剂10min后，带回实验室进行外植体清洁，首先将洗衣粉和洗衣液各称取0.25g溶于250ml的水里得到清洁液，再将外植体置于清洁液中浸泡20min，然后仔细清洗外植体表面，叶片正面用手轻轻摸洗，叶片背面和叶基部用软毛刷刷洗，将其表面的尘土和部分菌体除去，然后再用流动的自来水冲洗4h，以备使用；(2)、外植体的消毒将步骤(1)处理后的外植体置于超净工作台中，超净工作台提前打开，做好台面消毒工作，使其处于鼓风状态，先用ph值为6.5，有效氯素浓度为30mg/l的消毒剂浸泡30min，再用0.1％升汞溶液消毒10min后用无菌水冲洗8次，再用无菌滤纸擦干表面水珠备用；(3)、外植体的切割和接种将消毒过后的外置体置于切割盘里，用灭过菌的镊子和切割刀切取外植体，叶片切成1cm*1cm的大小的外植体方块，切割成为平整切口，选取叶片部位有叶缘、叶肉、叶脉或叶基部的外植体方块，然后外植体方块叶面背面朝上接种于培养基中培养，每个培养基中接种5个外植体方块；(4)、外植体的愈伤诱导培养将外植体方块接种于ms+ba5.0mg/l+naa5.0mg/l+葡萄籽提取物原花青素0.2g/l+蔗糖30g/l+琼脂7.5g/l,ph值为6.0的培养基中，先在25℃条件下暗培养7天，然后置于每天光照12小时，光照强度为2500lx的培养室中培养，愈伤诱导效果见附图3的外植体培养图。对比例1外植体消毒用75％的酒精代替消毒液，其余步骤与实施例1完全一样。表1是实施例1-3和对比例1的外植体污染率和愈伤诱导率项目污染率％愈伤诱导率％实施例1478.2实施例2383.5实施例3198.1对比例1963.3表1表1可以看出与常规消毒手段比，外植体分别通过消毒剂和0.1％的升汞溶液消毒除菌后，可以降低污染率，提高愈伤诱导率。对比例2将外植体接种在无葡萄籽提取物原花青素得培养基中培养，其余步骤与实施例2完全一样。表2是实施例1-3和对比例2的外植体褐化率，外植体褐化颜色等级和愈伤组织状态项目褐化率％褐化颜色等级愈伤组织状态实施例135.4轻度褐变白色偏绿实施例229.7轻度褐变淡绿色实施例323.6轻度褐变淡绿色对比例265.2黑褐色乳白色表2表2可以看出在培养基中加入葡萄籽提取物原花青素可以提高外植体的抗氧化能力，减少外植体的褐化，有利于诱导出健康的愈伤组织。对比例3采摘幼嫩叶片时不喷洒保水剂，直接采摘，其余步骤同实施例3完全一样。表3是实施例1-3和对比例3的外植体愈伤诱导率项目实施例1实施例2实施例3对比例3愈伤诱导率％78.283.598.151.7表3采集幼嫩叶片时，向其喷洒少许保水剂，可以提高愈伤诱导率。对比例4外植体方块叶面正面朝上接种于培养基，其余步骤同实施例3完全一样。表4是实施例1-3和对比例4的外植体愈伤出现时间和愈伤诱导率项目实施例1实施例2实施例3对比例4愈伤出现时间(天)65312愈伤诱导率％78.283.598.157.3表4外植体方块叶面背面朝上接种于培养基，由于桢楠背面叶脉有突出，培养时叶脉比叶片四周切口处优先出现愈伤组织，有利于外植体愈伤诱导，加快出现愈伤，提高愈伤诱导率，同时也利于观察。对比例5外植体采集的母树是于2017年3月份从四川林业科学研究院引种栽植于安徽农业大学农萃园的1年生桢楠幼苗，选用顶梢萌发新长出的枝条，然后再从枝条上选择幼芽为外植体，其余步骤与实施例1完全一样。表5是实施例1-3和对比例5的外植体愈伤出现时间和愈伤诱导率项目实施例1实施例2实施例3对比例5愈伤出现时间(天)65315愈伤诱导率％78.283.598.146.4表5可以看出选用1年生的桢楠幼苗顶梢或根部萌发新长出的枝条，再从该枝条上选择生长健壮、叶色鲜艳无斑点、无病虫害的幼嫩叶片为外植体，其具有较高的形态发生能力和诱导分化能力，可以加快出现愈伤，提高外植体的愈伤诱导率。以上所述实施方式仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。当前第1页12