本发明属于微生物培养技术领域，具体涉及一种冬虫夏草菌液体培养基及高效获得冬虫夏草寄主昆虫感染用芽生孢子的方法。
背景技术：
冬虫夏草是冬虫夏草菌ophiocordycepssinensis(berk)侵染蝙蝠蛾科hepialidae幼虫形成的僵虫与真菌子座复合体，具有重要的药用和经济价值，与人参、鹿茸被誉为中华医学三大宝。由于其生境特殊(仅在高寒地区自然繁衍)，生长速度缓慢，周期较长，自然资源极为有限，有关部门已将冬虫夏草列为国家二级保护物种。
近年来，由于国内外对冬虫夏草的需求迅猛增长，资源面临枯竭。通过人工培育冬虫夏草既可以满足国民需求和市场需要，又能保护生物资源和生态环境。经过30多年的研究，中华被毛孢人工培养和寄主蝠蛾幼虫的规模化饲养技术均取得很大进展，但如何快速获得冬虫夏草寄主昆虫感染用芽生孢子，提高中华被毛孢侵染幼虫形成僵虫并长出子座的成功率，缩短子座培养时间是目前冬虫夏草人工培育产业面临的重要问题。
技术实现要素：
本发明的目的是为了克服现有技术中的缺陷，提供一种冬虫夏草菌液体培养基及高效获得冬虫夏草寄主昆虫感染用芽生孢子的方法。
本发明的第一个目的是提供一种冬虫夏草菌液体培养基，每升含有土豆150～300g、蛋白胨10～30g、麦芽糖20～40g、硫酸镁0.5～1.5g、磷酸二氢钾1.5～30g、维生素b120～30g、大蜡螟幼虫研磨液5～10g，余量为水。
所述的大蜡螟幼虫研磨液优选为大蜡螟5龄幼虫研磨液。
本发明的第二个目的是提供一种所述的冬虫夏草菌液体培养基的制备方法，每升培养基是通过以下方法配制的：称取150～300g去皮土豆，加水煮沸，过滤得到土豆液，再加入蛋白胨10～30g、麦芽糖20～40g、硫酸镁0.5～1.5g、磷酸二氢钾1.5～30g、维生素b120～30g和大蜡螟幼虫研磨液5～10g，加水定容至1000ml。
本发明的第三个目的是提供一种高效获得冬虫夏草寄主昆虫感染用芽生孢子的方法，包括以下步骤：将中华被毛孢菌丝块接种到所述的冬虫夏草菌液体培养基中，于12±3℃，转速为80～120转/分，黑暗条件下培养30天，获得冬虫夏草寄主昆虫感染用芽生孢子。
所述的菌丝块优选为表面粘液状的菌丝块。
本发明的培养基和方法大大缩短了获得芽生孢子的培养时间，可以得到大量冬虫夏草寄主昆虫感染用芽生孢子，为冬虫夏草人工培育产业化发展提供技术支撑。
附图说明：
图1是本发明用于接种液体培养基的中华被毛孢菌落形态(菌落表面粘液状)。
图2是中华被毛孢菌落形态(菌落表面已长气生菌丝)。
图3是本发明培养得到的冬虫夏草菌(中华被毛孢)芽生孢子的镜检图(400×)。
图4是本发明制备的冬虫夏草菌(中华被毛孢)芽生孢子荧光28染色后的镜检图(400×)。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
本实施例的冬虫夏草菌液体培养基，每升培养基是通过以下方法配制的：称取300g去皮土豆，切丝，加适量水煮沸，小火再煮20min后，冷却，过滤得到土豆液；称取蛋白胨30g、麦芽糖40g、硫酸镁1.5g、磷酸二氢钾30g和维生素b1(需研磨成粉末)30g，加水搅拌均匀，得到溶液a；将溶液a和土豆液混合，得到混合液，称取大蜡螟5龄幼虫10g，将大蜡螟5龄幼虫研磨成粘液，得到大蜡螟5龄幼虫研磨液，将大蜡螟5龄幼虫研磨液加入到混合液中，加水定容至1000ml，121℃高压灭菌30min，置于12±3℃培养室预冷备用。
将中华被毛孢(ophiocordycepssinensis)接种至ppda固体培养基上，在12±3℃，黑暗条件下培养30d(图1)，挑取表面粘液状的菌丝块(菌丝块大小为0.3cm×0.5cm)接入到装有100ml冬虫夏草菌液体培养基的250ml三角瓶中，将接种菌丝块的三角瓶放置于无菌恒温暗室中的转速为120转/分的摇床，于12±3℃，黑暗条件下培养，30天后，取出1ml培养菌液，血球计数板计数，显微镜下镜检芽生孢子(图3-4)的数量达到3.44×107个/ml。
实施例2：
本实施例的冬虫夏草菌液体培养基，每升培养基是通过以下方法配制的：称取150g去皮土豆，切丝，加适量水煮沸，小火再煮20min后，冷却，过滤得到土豆液；称取蛋白胨10g、麦芽糖20g、硫酸镁0.5g、磷酸二氢钾1.5g和维生素b1(需研磨成粉末)20g，加水搅拌均匀，得到溶液a；将溶液a和土豆液混合，得到混合液，称取大蜡螟5龄幼虫5g，将大蜡螟5龄幼虫研磨成粘液，得到大蜡螟5龄幼虫研磨液，将大蜡螟5龄幼虫研磨液加入到混合液中，加水定容至1000ml，121℃高压灭菌30min，置于12±3℃培养室预冷备用。
将中华被毛孢(ophiocordycepssinensis)接种至ppda固体培养基，在12±3℃，黑暗条件下培养30d(图1)，挑取表面粘液状的菌丝块(菌丝块大小0.3cm×0.5cm)接入到装有100ml冬虫夏草菌液体培养基的250ml三角瓶中，将接种菌丝块的三角瓶放置于无菌恒温暗室中的转速为80转/分的摇床，于12±3℃，黑暗条件下培养，30天后，取出1ml培养菌液，血球计数板计数，显微镜下镜检芽生孢子(图3-4)的数量达到2.98×107个/ml。
实施例3：
本实施例的冬虫夏草菌液体培养基，每升培养基是通过以下方法配制的：称取300g去皮土豆，切丝，加适量水煮沸，小火再煮20min后，冷却，过滤得到土豆液；称取蛋白胨30g、麦芽糖40g、硫酸镁1.5g、磷酸二氢钾30g和维生素b1(需研磨成粉末)30g，加水搅拌均匀，得到溶液a；将溶液a和土豆液混合，得到混合液，称取大蜡螟5龄幼虫10g，将大蜡螟5龄幼虫研磨成粘液，得到大蜡螟5龄幼虫研磨液，将大蜡螟5龄幼虫研磨液加入到混合液中，加水定容至1000ml，121℃高压灭菌30min，置于12±3℃培养室预冷备用。
将中华被毛孢(ophiocordycepssinensis)接种至ppda固体培养基，在12±3℃，黑暗条件下培养90d(图2)，挑取表面布满气生菌丝的硬质菌丝块(菌丝块大小0.3cm×0.5cm)接入到装有100ml冬虫夏草菌液体培养基的250ml三角瓶中，将接种菌丝块的三角瓶放置于无菌恒温暗室中的转速为120转/分的摇床，于12±3℃，黑暗条件下培养，30天后，取出1ml培养菌液，血球计数板计数，显微镜下镜检芽生孢子(图3-4)的数量达到8.6×105个/ml。
实施例4：
本实施例的冬虫夏草菌液体培养基，每升培养基是通过以下方法配制的：称取300g去皮土豆，切丝，加适量水煮沸，小火再煮20min后，冷却，过滤得到土豆液；称取蛋白胨30g、麦芽糖40g、硫酸镁1.5g、磷酸二氢钾30g和维生素b1(需研磨成粉末)30g，加水搅拌混匀，然后加入到土豆液中，加水定容至1000ml，121℃高压灭菌30min，置于12±3℃培养室预冷备用。
将中华被毛孢(ophiocordycepssinensis)接种至ppda固体培养基，在12±3℃，黑暗条件下培养30d(图1)，挑取表面粘液状的菌丝块(菌丝块大小0.3cm×0.5cm)接入到装有100ml冬虫夏草菌液体培养基的250ml三角瓶中，将接种菌丝块的三角瓶放置于无菌恒温暗室的转速为120转/分的摇床，于12±3℃，黑暗条件下培养，30天后，取出1ml培养菌液，血球计数板计数，显微镜下镜检芽生孢子(图3-4)的数量达到4×104个/ml。
实施例5：
本实施例的冬虫夏草菌液体培养基，每升培养基是通过以下方法配制的：称取150g去皮土豆，切丝，加适量水煮沸，小火再煮20min后，冷却，过滤得到土豆液；称取蛋白胨10g、麦芽糖20g、硫酸镁0.5g、磷酸二氢钾1.5g和维生素b1(需研磨成粉末)20g，加水搅拌均匀，然后加入到土豆液中，加水定容至1000ml，121℃高压灭菌30min，置于12±3℃培养室预冷备用。
将中华被毛孢(ophiocordycepssinensis)接种至ppda固体培养基，在12±3℃，黑暗条件下培养90d(图2)，挑取表面布满气生菌丝的硬质菌丝块(菌丝块大小0.3cm×0.5cm)接入到装有100ml冬虫夏草菌液体培养基的250ml三角瓶中，将接种菌丝块的三角瓶放置于无菌恒温暗室的转速为80转/分的摇床，于12±3℃，黑暗条件下培养，30天后，取出1ml培养菌液，血球计数板计数，显微镜下镜检芽生孢子(图3-4)的数量达到1×104个/ml。
实施例6：
本实施例的冬虫夏草菌液体培养基，每升培养基是通过以下方法配制的：称取300g去皮土豆，切丝，加适量水煮沸，小火再煮20min后，冷却，过滤得到土豆液；称取蛋白胨10g、麦芽糖20g、硫酸镁1.5g、磷酸二氢钾30g和维生素b1(需研磨成粉末)20g，加水搅拌均匀，得到溶液a；将溶液a和土豆液混合，得到混合液，称取大蜡螟5龄幼虫5g，将大蜡螟5龄幼虫研磨成粘液，得到大蜡螟5龄幼虫研磨液，将大蜡螟5龄幼虫研磨液加入到混合液中，加水定容至1000ml，121℃高压灭菌30min，置于12±3℃培养室预冷备用。
将中华被毛孢(ophiocordycepssinensis)接种至ppda固体培养基，在12±3℃，黑暗条件下培养30d(图1)，挑取表面粘液状的菌丝块(菌丝块大小0.3cm×0.5cm)接入到装有100ml冬虫夏草菌液体培养基的250ml三角瓶中，将接种菌丝块的三角瓶放置于无菌恒温暗室的转速为80转/分的摇床，于12±3℃，光照(普通日光灯，光照度约为200lux)条件下培养，30天后，取出1ml培养菌液，血球计数板计数，显微镜下镜检发现并无芽生孢子产生。
实施例7：
本实施例的冬虫夏草菌液体培养基，每升培养基是通过以下方法配制的：称取300g去皮土豆，切丝，加适量水煮沸，小火再煮20min后，冷却，过滤得到土豆液；称取蛋白胨30g、葡萄糖40g、硫酸镁1.5g、磷酸二氢钾30g和维生素b1(需研磨成粉末)30g，加水搅拌均匀，得到溶液a；将溶液a和土豆液混合，得到混合液，称取大蜡螟5龄幼虫10g，将大蜡螟5龄幼虫研磨成粘液，得到大蜡螟5龄幼虫研磨液，将大蜡螟5龄幼虫研磨液加入到混合液中，加水定容至1000ml，121℃高压灭菌30min，置于12±3℃培养室预冷备用。
将中华被毛孢(ophiocordycepssinensis)接种至ppda固体培养基，在12±3℃，黑暗条件下培养30d(图1)，挑取表面粘液状的菌丝块(菌丝块大小0.3cm×0.5cm)接入到装有100ml冬虫夏草菌液体培养基的250ml三角瓶中，将接种菌丝块的三角瓶放置于无菌恒温暗室中的转速为120转/分的摇床，于12±3℃，黑暗条件下培养，30天后，取出1ml培养菌液，血球计数板计数，显微镜下镜检，并未发现有芽生孢子产生。
实施例8：
本实施例的冬虫夏草菌液体培养基，每升培养基是通过以下方法配制的：称取150g去皮土豆，切丝，加适量水煮沸，小火再煮20min后，冷却，过滤得到土豆液；称取蛋白胨10g、葡萄糖20g、硫酸镁0.5g、磷酸二氢钾1.5g和维生素b1(需研磨成粉末)20g，加水搅拌均匀，再加入到土豆液中，加水定容至1000ml，121℃高压灭菌30min，置于12±3℃培养室预冷备用。
将中华被毛孢(ophiocordycepssinensis)接种至ppda固体培养基，在12±3℃，黑暗条件下培养30d(图1)，挑取表面粘液状的菌丝块(菌丝块大小0.3cm×0.5cm)接入到装有100ml冬虫夏草菌液体培养基的250ml三角瓶中，将接种菌丝块的三角瓶放置于无菌恒温暗室中的转速为80转/分的摇床，于12±3℃，黑暗条件下培养，30天后，取出1ml培养菌液，血球计数板计数，显微镜下镜检发现并无芽生孢子产生。
实施例9：
本实施例的冬虫夏草菌液体培养基，每升培养基是通过以下方法配制的：称取150g去皮土豆，切丝，加适量水煮沸，小火再煮20min后，冷却，过滤得到土豆液；称取蛋白胨10g、葡萄糖20g、硫酸镁0.5g、磷酸二氢钾1.5g和维生素b1(需研磨成粉末)20g，加水搅拌均匀，得到溶液a；将溶液a和土豆液混合，得到混合液，称取大蜡螟5龄幼虫5g，将大蜡螟5龄幼虫研磨成粘液，得到大蜡螟5龄幼虫研磨液，将大蜡螟5龄幼虫研磨液加入到混合液中，加水定容至1000ml，121℃高压灭菌30min，置于12±3℃培养室预冷备用。
将中华被毛孢(ophiocordycepssinensis)接种至ppda固体培养基，在12±3℃，黑暗条件下培养90d(图2)，挑取表面布满气生菌丝的硬质菌丝块(菌丝块大小0.3cm×0.5cm)接入到装有100ml冬虫夏草菌液体培养基的250ml三角瓶中，将接种菌丝块的三角瓶放置于无菌恒温暗室中的转速为80转/分的摇床，于12±3℃，黑暗条件下培养，30天后，取出1ml培养菌液，血球计数板计数，显微镜下镜检发现并无芽生孢子产生。
实施例10：
本实施例的冬虫夏草菌液体培养基，每升培养基是通过以下方法配制的：称取150g去皮土豆，切丝，加适量水煮沸，小火再煮20min后，冷却，过滤得到土豆液；称取蛋白胨10g、麦芽糖20g、硫酸镁0.5g、磷酸二氢钾1.5g和维生素b1(需研磨成粉末)20g，加水搅拌均匀，得到溶液a；将溶液a和土豆液混合，得到混合液，称取大蜡螟5龄幼虫5g，将大蜡螟5龄幼虫研磨成粘液，得到大蜡螟5龄幼虫研磨液，将大蜡螟5龄幼虫研磨液加入到混合液中，加水定容至1000ml，121℃高压灭菌30min，置于12±3℃培养室预冷备用。
将中华被毛孢(ophiocordycepssinensis)接种至ppda固体培养基，在12±3℃，黑暗条件下培养90d(图2)，挑取表面布满气生菌丝的硬质菌丝块(菌丝块大小0.3cm×0.5cm)接入到装有100ml冬虫夏草菌液体培养基的250ml三角瓶中，将接种菌丝块的三角瓶放置于无菌恒温暗室中的转速为120转/分的摇床，于12±3℃，光照(普通日光灯，光照度约为200lux)条件下培养，30天后，取出1ml培养菌液，血球计数板计数，显微镜下镜检发现并无芽生孢子产生。