专利名称：用家蚕培育生产冬虫夏草的方法
技术领域：
本发明涉及用家蚕培育生产冬虫夏草的方法。
冬虫夏草是冬虫夏草菌(Cordyceps sinensis)寄生于虫草蝙蝠蛾(Hepialusarmoricanus)等昆虫体上后所形成的菌虫复合物，主产于我国的四川、青海、西藏、云南、甘肃等海拔3500～5000米的高山灌丛和高山草甸中，与人参、鹿茸齐名为我国的三大名贵滋补防病中药材。但是，由于冬虫夏草菌的天然寄主昆虫的虫草蝙蝠蛾生活周期长，并且多病害多天敌，即自然繁殖的虫源不足。再之，近几年来环境污染，草甸沙化，人为过早过量地滥采滥挖而使未成熟的虫草减少了感染寄主的机会等，使冬虫夏草数量和质量急剧下降，其自然资源逐趋枯竭，有的产区已挖不到冬虫夏草，濒临灭绝状态，远远不能满足国内外市场日益增长的需求。
为了弥补冬虫夏草供需之间的巨大缺口，目前采取人工培育的方法来生产冬虫夏草的代用品。其人工培育的方法主要有二类1)采用人工液体培养方法，获得冬虫夏草菌的菌丝和发酵产物，制成“至灵胶囊”等产品供应市场。但此类方法存在易杂菌混杂、有效成分易分解破坏、菌丝与发酵产物的药理药化不稳定等问题，并且该产物既没有“草”也没有“虫”，从本质上讲并不是冬虫夏草，与天然的冬虫夏草相距甚远。2)人工饲养虫草蝙蝠蛾幼虫，再人工接种冬虫夏草菌以培育冬虫夏草。但此类方法存在虫草蝙蝠蛾生活世代周期长、生活制约因素多、饲养大多依赖于自然条件、在室内难以很好地完成世代交替、费用成本高、效益差等问题，至今未见有推广应用于生产。
本发明的目的是用家蚕(Bombyx mori L.)替代虫草蝙蝠蛾幼虫，对冬虫夏草菌作理化生物学处理后，接种于家蚕体，再模拟天然环境，使冬虫夏草菌侵染寄生家蚕体并长出子座的用家蚕培育生产冬虫夏草的方法。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方法如下一种是采集特级冬虫夏草，用0.1～0.2％升汞液表面消毒后，切取组织块置于PDA培养基上培养，分离出冬虫夏草菌；用4～8mg/mL Driselase酶液振荡处理处于对数生长期的冬虫夏草菌幼嫩菌丝，分离出原生质体；将原生质体置于相距10～30cm的15W紫外灯下照射20～60sec，获得对家蚕具有感染寄生性的突变体；以30～40％PEG-Ca++为融合诱导剂，将对家蚕具有感染寄生性的冬虫夏草菌突变体的原生质体与原冬虫夏草菌的原生质体融合，以菌丝的虫草素、虫草酸、虫草多糖含量和对家蚕的感染寄生性为指示性状，从中培育筛选出既保持了冬虫夏草菌原有性状又能感染寄生家蚕体并很好地生长的冬虫夏草菌菌株；将冬虫夏草菌菌株在1000mL蒸馏水中含100～150g马铃薯、30～40g蛋白胨、30～40g葡萄糖、1g磷酸氢二钾、0.5g硫酸镁、10～15g牛肉膏、20～30g新鲜蚕蛹粉、17～20g琼脂、pH5.0的培养基上培养繁殖后接种于家蚕体；在温度10～30℃、湿度70～100％、光照6～24h/日的洁净环境下保护，使冬虫夏草菌菌株在蚕幼虫体内或蚕蛹体内充分生长并最后长出子座。待子座长至5～7cm时收获，在50～60℃下干燥，用于制成中成新药。
另一种是采集特级冬虫夏草，用0.1～0.2％升汞液表面消毒后，切取组织块置于PDA培养基上培养，分离出冬虫夏草菌；用4～8mg/mL Driselase酶液振荡处理处于对数生长期的冬虫夏草菌幼嫩菌丝，分离出原生质体；从白僵蚕体中分离出家蚕病原白僵菌，用4～8mg/ml Driselase酶液振荡处理处于对数生长期的家蚕病原白僵菌幼嫩菌丝，分离出原生质体；以30～40％PEG-Ca++为融合诱导剂，将家蚕病原白僵菌的原生质体与冬虫夏草菌的原生质体融合，以菌丝的虫草素、虫草酸、虫草多糖含量和对家蚕的感染寄生性为指示性状，从中培育筛选出既保持了冬虫夏草菌原有性状又能感染寄生家蚕体并很好地生长的冬虫夏草菌菌株；将冬虫夏草菌菌株在1000mL蒸馏水中含100～150g马铃薯、30～40g蛋白胨、30～40g葡萄糖、1g磷酸氢二钾、0.5g硫酸镁、10～15g牛肉膏、20～30g新鲜蚕蛹粉、17～20g琼脂、pH5.0的培养基上培养繁殖后接种于家蚕体；在温度10～30℃、湿度70～100％、光照6～24h/日的洁净环境下保护，使冬虫夏草菌菌株在蚕幼虫体内或蚕蛹体内充分生长并最后长出子座；待子座长至5～7cm时收获，在50～60℃下干燥，用于制成中成新药。
以上两种方法的接种方法为取菌丝和分生孢子入灭菌水中，制成浓度为106～108/mL的菌液，喷洒于2～5龄刚蜕皮的洁净蚕幼虫体表面或化蛹第1～2天的洁净蚕蛹体表面；或用接种针蘸取菌丝和分生孢子，穿破体皮直接接种于2～5龄的洁净蚕幼虫体内或化蛹第1～12天的洁净蚕蛹体内。
本发明具有的优点是它能充分利用我国丰富的家蚕资源，培育出既有“虫”又有“草”并相似于天然的冬虫夏草，来合理保护和利用冬虫夏草这一我国稀有珍贵中药材，满足国内外市场的需求，并用高附加值的冬虫夏草来发展振兴我国传统的养蚕业；用本发明培育生产冬虫夏草容易，成本低，能创造出巨大的社会效益和经济效益。
下面是本发明的实施例。实施例1．用6mg/mL Driselase酶液处理冬虫夏草菌的菌丝，分离出原生质体，将原生质体置于相距20cm的15W紫外灯下照射45sec，获得对家蚕具有感染寄生性的突变体，以35％PEG-Ca++为融合诱导剂，将对家蚕具有感染寄生性的冬虫夏草菌突变体的原生质体与原冬虫夏草菌的原生质体融合，以菌丝的虫草素、虫草酸、虫草多糖含量和对家蚕的感染寄生性为指示性状，从中培育筛选出既保持了冬虫夏草菌原有性状又能感染寄生家蚕体并很好地生长的冬虫夏草菌菌株，经培养繁殖后，制成浓度为107/mL的分生孢子液，喷洒于化蛹第1天的生产用品种菁松的洁净蚕蛹体表面，略干后置温度25℃湿度100％的洁净自然光照环境下保护，待蚕蛹体僵硬后换置温度20℃、湿度95％、60W日光灯每日照射18h的洁净环境下保护。结果冬虫夏草菌菌株侵染寄生蚕蛹体，在体内充分生长后伸出体外形成子座，其子座的色泽、形态与天然冬虫夏草相似，长出子座并能很好生长的百分率为95.8％，接种20批次都得到相同的结果。
权利要求
1．用家蚕培育生产冬虫夏草的方法，其特征在于1)采集特级冬虫夏草，用0.1～0.2％升汞液表面消毒后，切取组织块置于PDA培养基上培养，分离出冬虫夏草菌；用4～8mg/mL Driselase酶液振荡处理处于对数生长期的冬虫夏草菌幼嫩菌丝，分离出原生质体；将原生质体置于相距10～30cm的15W紫外灯下照射20～60sec，获得对家蚕具有感染寄生性的突变体；以30～40％PEG-Ca++为融合诱导剂，将对家蚕具有感染寄生性的冬虫夏草菌突变体的原生质体与原冬虫夏草菌的原生质体融合，以菌丝的虫草素、虫草酸、虫草多糖含量和对家蚕的感染寄生性为指示性状，从中培育筛选出既保持了冬虫夏草菌原有性状又能感染寄生家蚕体并很好地生长的冬虫夏草菌菌株；将冬虫夏草菌菌株在1000mL蒸馏水中含100～150g马铃薯、30～40g蛋白胨、30～40g葡萄糖、1g磷酸氢二钾、0.5g硫酸镁、10～15g牛肉膏、20～30g新鲜蚕蛹粉、17～20g琼脂、pH5.0的培养基上培养繁殖后接种于家蚕体2)在温度10～30℃、湿度70～100％、光照6～24 h/日的洁净环境下保护，使冬虫夏草菌菌株在蚕幼虫体内或蚕蛹体内充分生长并最后长出子座；3)待子座长至5～7cm时收获，在50～60℃下干燥，用于制成中成新药。
2．根据权利要求1所述的用家蚕培育生产冬虫夏草的方法，其特征在于接种方法为取菌丝和分生孢子入灭菌水中，制成浓度为106～108/mL的菌液，喷洒于2～5龄刚蜕皮的洁净蚕幼虫体表面或化蛹第1～2天的洁净蚕蛹体表面；或用接种针蘸取菌丝和分生孢子，穿破体皮直接接种于2～5龄的洁净蚕幼虫体内或化蛹第1～12天的洁净蚕蛹体内。
3．用家蚕培育生产冬虫夏草的方法，其特征在于1)采集特级冬虫夏草，用0.1～0.2％升汞液表面消毒后，切取组织块置于PDA培养基上培养，分离出冬虫夏草菌；用4～8mg/mL Driselase酶液振荡处理处于对数生长期的冬虫夏草菌幼嫩菌丝，分离出原生质体；从白僵蚕体中分离出家蚕病原白僵菌，用4～8mg/mL Driselase酶液振荡处理处于对数生长期的家蚕病原白僵菌幼嫩菌丝，分离出原生质体；以30～40％ PEG-Ca++为融合诱导剂，将家蚕病原白僵菌的原生质体与冬虫夏草菌的原生质体融合，以菌丝的虫草素、虫草酸、虫草多糖含量和对家蚕的感染寄生性为指示性状，从中培育筛选出既保持了冬虫夏草菌原有性状又能感染寄生家蚕体并很好地生长的冬虫夏草菌菌株；将冬虫夏草菌菌株在1000mL蒸馏水中含100～150g马铃薯、30～40g蛋白胨、30～40g葡萄糖、1g磷酸氢二钾、0.5g硫酸镁、10～15g牛肉膏、20～30g新鲜蚕蛹粉、17～20g琼脂、pH5.0的培养基上培养繁殖后接种于家蚕体；2)在温度10～30℃、湿度70～100％、光照6～24h/日的洁净环境下保护，使冬虫夏草菌菌株在蚕幼虫体内或蚕蛹体内充分生长并最后长出子座；3)待子座长至5～7cm时收获，在50～60℃下干燥，用于制成中成新药。
4．根据权利要求3所述的用家蚕培育生产冬虫夏草的方法，其特征在于接种方法为取菌丝和分生孢子入灭菌水中，制成浓度为106～108/mL的菌液，喷洒于2～5龄刚蜕皮的洁净蚕幼虫体表面或化蛹第1～2天的洁净蚕蛹体表面；或用接种针蘸取菌丝和分生孢子，穿破体皮直接接种于2～5龄的洁净蚕幼虫体内或化蛹第1～12天的洁净蚕蛹体内。
全文摘要
本发明公开的是用家蚕(Bombyx mori L.)培育生产冬虫夏草的方法,利用我国丰富的家蚕资源,对冬虫夏草菌作理化生物学处理后,接种于家蚕体,再模拟天然环境,使冬虫夏草菌侵染寄生家蚕体并最后长出子座,培育出相似于天然的冬虫夏草。本发明培育生产冬虫夏草容易、成本低,不仅有利于合理保护和利用冬虫夏草这一我国稀有珍贵资源,满足国内外市场需求,而且能创造出巨大的社会效益和经济效益。
文档编号C12N1/14GK1304995SQ0110327
公开日2001年7月25日 申请日期2001年1月19日 优先权日2001年1月19日
发明者时连根, 钟伯雄 申请人:浙江大学