专利名称：蝙蝠蛾幼虫内源加压人工感染中国被毛孢培养虫草的方法
技术领域：
本发明属冬虫夏草的人工培养技术领域，具体为冬虫夏草培育过程中蝙蝠蛾幼虫内源加压人工感染中国被毛孢的方法。
背景技术：
冬虫夏草是一种十分名贵的药用真菌，它是昆虫蝙蝠蛾幼虫感染中国被毛孢 (Hirsutalla sinensis)后，形成的蝙蝠蛾幼虫的真菌感染体。受该真菌感染的蝙蝠蛾幼虫，因感染后体内长满该真菌而死亡，之后在特殊环境条件下，从蝙蝠蛾死后幼虫体上长出的“草”是真菌中国被毛孢的子实体一子座。真菌中国被毛孢在分类学上属子囊菌亚门Ascomycotina，核菌纲Pyrenomycetes， 麦角菌目Clavicipitales。也有许多文献资料将中国被毛孢用于虫菌感染复合体冬虫夏草。中国被毛孢已被人工从冬虫夏草虫体上分离并广泛培养。真菌中国被毛孢的培养方法及菌株生物学等研究工作已有大量报道。现在人工培养冬虫夏草的报道较多。蛹虫草又称北冬虫夏草，是蛹草菌 (Cordyceps militaris)寄生在夜蛾科等昆虫的蛹上。蛹虫草与冬虫夏草不仅感染的对象不同，真菌的种类差别也大。在冬虫夏草人工培养方面，多数是中国被毛孢培养的报道。对蝙蝠蛾幼虫人工感染方法及之后的特殊环境培养子实体的报道较少。蝙蝠蛾幼虫人工感染是人工培养冬虫夏草过程的关键环节。只有蝙蝠蛾幼虫感染中国被毛孢后，才可能进一步在特殊的环境条件下培养，让感染体长出子实体一子座。现已公开的感染方法有两种，一是用真菌中国被毛孢的孢子喷洒于幼虫体表，孢子萌发后有可能感染蝙蝠蛾幼虫；二是让蝙蝠蛾幼虫在大量培养真菌中国被毛孢的环境中生活，让其自然感染。上述两种方法随机性大，感染率很低，周期长，成本高，有失商业或人工大规模培养的意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的上述缺点，为冬虫夏草的人工培养提供一种具有商业价值的方法，即蝙蝠蛾幼虫内源加压人工感染中国被毛孢培养虫草的方法。本发明方法包括以下步骤
1、制作无菌感染原液，将以下重量比的成分混合
家蚕蛹28 ；34%，
马铃薯5 7%，
硫酸镁0. 008 0. 01%,
磷酸二氢钾0. 035 0. 05%,
余量为水，
经煮沸，过滤，灭菌制成无菌感染原液。制作无菌感染原液的最佳方法是家蚕蛹500克+马铃薯100克+硫酸镁0. 15克+磷酸二氢钾0. 7克+水1000克，煮沸时间大于30分钟，用25 28号绢网过滤，滤液如果少于500毫升，用蒸馏水定容至500毫升，滤液如果大于500毫升，将滤液加热浓缩至500 毫升，滤液经灭菌后制成无菌感染原液。2、制作感染源菌液，采用中国被毛孢为感染菌源，用接种针挑离其纯菌丝体放于无菌感染原液中，放入量为每5毫升无菌感染原液中放入10 15针所挑离的中国被毛孢， 研磨后制成感染源菌液。真菌中国被毛孢的培养方法为已有技术。取真菌的纯菌丝体放于液体中的操作过程为本专业人员所知晓。最好是从长满中国被毛孢的培养瓶壁上，挑离纯菌丝体于无菌感染原液中，在钵中研磨1分钟以上制得感染源菌液。 3、用无菌2 4毫升注射器，吸取所得感染源菌液，将针头从蝙蝠蛾幼虫排泄口插入后，压入幼虫肠道感染源菌液0. 3 0. 5毫升，再将该幼虫于无光，17 21°C，相对湿度 78 85%的条件下培养，培养时间大于15天。本发明的有益效果感染率高达90%以上，周期短，成本低，在规模化培养虫菌复合体冬虫夏草的过程中，具有很好的应用前景。
具体实施例方式按照本发明方法给出的以下步骤，在所给条件范围内变化，从而分别进行具体试验，结果表明均能实现发明目的
1、制作无菌感染原液，将以下重量比的成分混合
家蚕蛹28 ；34%，
马铃薯5 7%，
硫酸镁0. 008 0. 01%,
磷酸二氢钾0. 035 0. 05%,
余量为水，
经煮沸，过滤，灭菌制成无菌感染原液。2、制作感染源菌液，采用中国被毛孢为感染菌源，用接种针挑离其纯菌丝体放于无菌感染原液中，放入量为每5毫升无菌感染原液中放入10 15针所挑离的中国被毛孢， 研磨后制成感染源菌液。3、用无菌2 4毫升注射器，吸取所得感染源菌液，将针头从蝙蝠蛾幼虫排泄口插入后，压入幼虫肠道感染源菌液0. 3 0. 5毫升，再将该幼虫于无光，17 21°C，相对湿度 78 85%的条件下培养，培养时间大于15天。以下为其中的一些实例。实施例1，按以下步骤进行
(1)制作无菌感染原液。把以下重量比的原料家蚕蛹31%，马铃薯6%，硫酸镁0. 009%, 磷酸二氢钾0. 045%，余量为水，混合后煮沸、过滤，灭菌后得无菌感染原液。(2)制作感染源菌液采用分离培养获得的纯培养中国被毛孢为感染菌源，用接种针在洁净工作台上，从纯培养的中国被毛孢培养瓶中，分离不带培养基的纯菌丝体10针于上步获得的无菌感染原液5ml中，在钵中研磨1分钟后制得感染源菌液。本实施例所说分离培养获得的纯培养中国被毛孢为感染菌源是将在云南省怒江州丙中洛乡采集的野生冬虫夏草，用组织分离法，在加富PDA的培养基上进行分离培养。(3)取采集到的蝙蝠蛾幼虫10条，幼虫平均长5. 3厘米。用3毫升无菌注射器吸取上步获得的感染源菌液，从幼虫排泄口插入0. 5 0. 8厘米，压入幼虫肠道感染源菌液 0.3毫升。再将该幼虫置于无光，18°C，相对湿度80%的可控温、湿培养箱中培养15天，取出观察，一条腐败，九条外形弯曲，颜色正常。将九条幼虫纵剖，用镊子分别取九条幼虫体内组织状做成水封片，显微镜下均观察到真菌中国被毛孢菌丝体，其中一条幼虫的菌丝较疏，其余八条的菌丝紧密。实施例2，按以下步骤进行
(1)制作无菌感染原液。把以下重量比的原料家蚕蛹28%，马铃薯7%，硫酸镁0. 01%, 磷酸二氢钾0. 037%，余量为水，混合后煮沸、过滤，浓缩，定容，灭菌后得无菌感染原液。(2)制作感染源菌液采用分离培养获得的纯培养中国被毛孢为感染菌源，用接种针在洁净工作台上，从纯培养的中国被毛孢培养瓶壁上，挑离不带培养基的纯菌丝体15针于上步获得的无菌感染原液每5ml中，在钵中研磨2分钟后制得感染源菌液。(3)取采集到的蝙蝠蛾幼虫20条，幼虫平均长5. 2厘米。用2毫升无菌注射器吸取上步获得的感染源菌液，从幼虫排泄口插入0. 4 0. 7厘米，压入幼虫肠道感染源菌液各 0. 5毫升。再将该幼虫置于无光，200C，相对湿度85%的可控温、湿培养箱中培养20天，取出观察，20条均不同程度弯曲，颜色正常。取幼虫体内组织状物水封片镜检，20条均均有中国被毛孢菌丝体浓密生长。实施例3，按以下步骤进行
(1)制作无菌感染原液。把以下重量比的原料家蚕蛹；34%，马铃薯5%，硫酸镁0. 008%, 磷酸二氢钾0. 05%，余量为水，混合后煮沸、过滤，浓缩，定容，灭菌后得无菌感染原液。(2)制作感染源菌液采用分离培养获得的纯培养中国被毛孢为感染菌源，用接种针在洁净工作台上，从纯培养的中国被毛孢培养瓶中，分离不带培养基的纯菌丝体14针于上步获得的无菌感染原液每5ml中，在钵中研磨1. 5分钟后制得感染源菌液。(3)取采集到的蝙蝠蛾幼虫50条，用4毫升无菌注射器吸取上步获得的感染源菌液，从幼虫排泄口插入0. 6 0. 9厘米，压入幼虫肠道感染源菌液各0. 4毫升。再将该幼虫置于无光，17°C，相对湿度78%的可控温、湿培养箱中培养22天，取出观察，1条腐烂，49条均不同程度弯曲。取幼虫体内组织状物水封片镜检，49条均有中国被毛孢菌丝体较浓密生长。实施例4，按以下步骤进行
(1)制作无菌感染原液。把以下重量比的原料家蚕蛹30%，马铃薯6%，硫酸镁0. 085%, 磷酸二氢钾0. 041%,余量为水，混合后煮沸、过滤，浓缩，定容，灭菌后得无菌感染原液。(2)制作感染源菌液采用分离培养获得的纯培养中国被毛孢为感染菌源，用接种针在洁净工作台上，从纯培养的中国被毛孢培养瓶中，挑离不带培养基的纯菌丝体12针于上步获得的无菌感染原液每5ml中，在钵中研磨2. 5分钟后制得感染源菌液。(3)取采集到的蝙蝠蛾幼虫15条，用3毫升无菌注射器吸取上步获得的感染源菌液，从幼虫排泄口插入0. 5 0. 8厘米，压入幼虫肠道感染源菌液各0. 4毫升。再将该幼虫置于无光，21°C，相对湿度85%的可控温、湿培养箱中培养21天，取出观察，15条均不同程度弯曲，颜色正常。取幼虫体内组织状物水封片镜检，15条均有中国被毛孢菌丝体浓密生长。实施例5，按以下步骤进行
(1)制作无菌感染原液。家蚕蛹500克+马铃薯100克+硫酸镁0. 15克+磷酸二氢钾0. 7克+水1000克，煮沸时间大于30分钟，用25号绢网过滤，滤液如果少于500毫升， 用蒸馏水定容至500毫升，滤液如果大于500毫升，将滤液加热浓缩至500毫升，滤液经灭菌后制成无菌感染原液。(2)制作感染源菌液采用分离培养获得的纯培养中国被毛孢为感染菌源，用接种针在洁净工作台上，从纯培养的中国被毛孢培养瓶中挑离纯菌丝体，每5ml无菌感染原液中挑离放入不带培养基的纯菌丝体15针，在钵中研磨1分钟后制得感染源菌液。(3)取蝙蝠蛾幼虫30条，用4毫升无菌注射器吸取上步获得的感染源菌液，从幼虫排泄口插入0. 3 0. 8厘米，压入幼虫肠道感染源菌液0. 3毫升。再将该幼虫置于无光， 18°C，相对湿度80%的可控温、湿培养箱中培养15天，取出观察，均外形弯曲，颜色正常。将幼虫纵剖，用镊子幼虫体内组织状做成水封片，显微镜下均观察到真菌中国被毛孢菌丝体， 全部幼虫的菌丝浓密。以上实施例仅仅是为了对发明方法作进一步说明，而本方法的范围不受所举实施例的局限。
权利要求
1.蝙蝠蛾幼虫内源加压人工感染中国被毛孢培养虫草的方法，其特征在于包括以下步骤(1)、制作无菌感染原液，将以下重量比的成分混合 家蚕蛹28 ；34%，马铃薯5 7%， 硫酸镁0. 008 0. 01%, 磷酸二氢钾0. 035 0. 05%, 余量为水，经煮沸，过滤，灭菌制成无菌感染原液；(2)、制作感染源菌液，采用中国被毛孢为感染菌源，用接种针挑离其纯菌丝体放于无菌感染原液中，放入量为每5毫升无菌感染原液中放入10 15针所挑离的中国被毛孢，研磨后制成感染源菌液；(3)、用无菌2 4毫升注射器，吸取所得感染源菌液，将针头从蝙蝠蛾幼虫排泄口插入后，压入幼虫肠道感染源菌液0. 3 0. 5毫升，再将该幼虫于无光，17 21°C，相对湿度 78 85%的条件下培养，培养时间大于15天。
2.如权利要求1所说的蝙蝠蛾幼虫内源加压人工感染中国被毛孢培养虫草的方法，其特征在于其中的步骤(1)为取家蚕蛹500克+马铃薯100克+硫酸镁0. 15克+磷酸二氢钾0. 7克+水1000克，煮沸时间大于30分钟，用25 观号绢网过滤，滤液如果少于500 毫升，用蒸馏水定容至500毫升，滤液如果大于500毫升，将滤液加热浓缩至500毫升，滤液经灭菌后制成无菌感染原液。
3.如权利要求1所说的蝙蝠蛾幼虫内源加压人工感染中国被毛孢培养虫草的方法，其特征在于其中的步骤(2)所说挑离是从长满中国被毛孢的培养瓶壁上挑离，所说研磨是在钵中研磨1分钟以上。
全文摘要
蝙蝠蛾幼虫内源加压人工感染中国被毛孢培养虫草的方法，属冬虫夏草的人工培养技术领域。将以下重量比的成分混合家蚕蛹28～34%，马铃薯5～7%，硫酸镁0.008~0.01%，磷酸二氢钾0.035~0.05%，余量为水，经煮沸，过滤，灭菌制成无菌感染原液。以中国被毛孢为感染菌源，用接种针挑离其纯菌丝体放于无菌感染原液中，每5毫升无菌感染原液中放入10～15针所挑离的中国被毛孢，研磨后制成感染源菌液。用注射器吸取感染源菌液，针头从蝙蝠蛾幼虫排泄口插入，压入幼虫肠道感染源菌液0.3～0.5毫升，再将幼虫于无光，17～21℃，相对湿度78～85%条件下培养大于15天。感染率高达90%以上，周期短成本低，对规模化培养虫草有很好应用前景。
文档编号A01G1/04GK102498947SQ201110347959
公开日2012年6月20日 申请日期2011年11月7日 优先权日2011年11月7日
发明者许继宏 申请人:许继宏