本发明涉及一种大田种植的含抗除草剂基因的水稻种子产品及其制备方法。
背景技术
水稻历来是我国第一大农作物。近年来，杂交水稻由于产量高、适应性强等特点种植面积不断扩大。据统计，杂交水稻的种植面积占全国水稻总面积的50％以上，杂交水稻的种植产量占全国水稻总产量的60％以上。因此，杂交水稻为我国粮食生产做出了巨大贡献，解决了我国的粮食危机。
在水稻制种过程中，保证杂交水稻种子纯度是保证杂交水稻产量的重要措施。依据gb4404.1-2008《粮食作物种子质量标准-禾谷类》，必须保证杂交水稻种子纯度不低于96％，因为一旦纯度不达标的杂交水稻种子大量销售给农户进行大田种植，就可能导致大田大量减产，给种植农户甚至当地农业生产带来巨额损失。同时，如果纯度不达标的杂交水稻种子在制种农户或者企业处滞销，也将给他们带来巨额损失并且影响其生产积极性。
为了提高纯度，对于三系杂交水稻，必须对制种田进行严格隔离，防止其他水稻品种花粉串交。例如，严格隔离的措施包括以下几种。
(1)利用空间距离进行隔离
依据gb/t17314-2011《籼型杂交水稻“三系”原种生产技术操作规程》的规定，不育系与异品种宜采用自然隔离，空间隔离距离700m以上。特殊情况下，如山丘、丘陵地带的背风区域隔离区可以适当减少，但不能低于50m。风力大的平原不能小于规定距离200m或500m。
(2)利用花期时间进行隔离
依据相关规定，杂交水稻制种田的花期与其它品种水稻的花期应当错开，始穗期错开25天以上。
(3)利用竖直屏障进行隔离
依据相关规定，用于隔离杂交水稻制种田的屏障包括山坡、树林、房屋和高杆作物，屏障高度应高于2米。
(4)利用其它作物进行隔离
依据相关规定，在杂交水稻制种田四周50米范围内可以种植与该杂交水稻相应的父本恢复系进行隔离，或者可以种植非水稻作物的旱地农作物进行隔离。
另外，为了提高三系杂交水稻种子的纯度，还需要组织人工田间去杂以及防止机械加工混杂等。
因此，传统的三系杂交制备水稻种子的纯度会受到以下因素影响：亲本的纯度，空间隔离距离不够，除杂时因人的识别能力及努力程度不同。
而且，传统的三系杂交制备水稻种子费时费力，成本高。
对于两系杂交水稻，通常使用光温敏型不育系进行制种。具体说来，光照和温度是影响制种的最大因素，在光照长，温度高时，光温敏型不育系表现为雄性不育，这时所有正常水稻品种都能与其正常杂交，生产用于大田种植的水稻种子；在光照短，温度低时，光温敏型不育系表现为正常水稻，自交结实，生产下一代光温敏型不育系。但是，两系杂交水稻的问题在于：受光照、温度以及区域影响特别明显，例如，一旦在幼穗分化的3-5期，气温低于临界温度，则光温敏型不育系将会部分自交结实，难以避免特殊天气导致种子纯度不达标。此外，亲本纯度也会影响两系杂交制种纯度。
综上所述，本领域仍然亟需高纯度的水稻种子，制备高纯度的水稻种子的方法以及能够解决因为种子纯度不达标而造成巨大经济损失的技术方案。
技术实现要素：
为了解决上述技术问题，本发明的一个目的在于提供一种高纯度水稻种子产品，对于采用两系和三系杂交制种方法，该水稻种子产品的纯度至少高于97％。本发明的另一个目的在于提供制备所述高纯度水稻种子产品的方法。
因此，一方面，本发明提供了一种大田种植的含抗除草剂基因的水稻种子产品，该水稻种子产品包括含抗除草剂基因的水稻种子和所述含抗除草剂基因的水稻种子能够抵抗的除草剂。
另一方面，本发明还提供了一种大田种植的含抗除草剂基因的水稻种子产品的制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)将恢复系或者父本与含抗除草剂基因的水稻育种材料杂交；
(2)将步骤(1)获得的水稻种子自交一次或多次，或者与所述恢复系或者父本回交一次或多次，或者与其它品种杂交一次或者多次；以及
(3)将步骤(2)获得的含抗除草剂基因的品系与三系或者两系不育系进行杂交，获得含抗除草剂基因的水稻种子；
(4)用步骤(3)获得的含抗除草剂基因的水稻种子能够抵抗的除草剂处理步骤(3)获得的含抗除草剂基因的水稻种子。
本发明提供的大田种植的含抗除草剂基因的水稻种子产品能够保证成苗的水稻品系纯度至少高于98％，在优选的实施方式中，成苗的水稻品系纯度大于或等于99％，甚至为100％。此外，本发明提供的一种大田种植的含抗除草剂基因的水稻种子产品的制备方法简单易行(例如，对于三系杂交制种：可以省去人工去杂；空间间隔可以适当缩小，亲本中保持系的纯度可以稍微降低，从而可以解决制种基地难落实的问题，也可以大大降低制种成本；而且对于三系育种及制种中有部分自交结实不稳定的不育系，也可以制备合格纯度的大田种植的种子；对于两系杂交制种，可以解决因温光条件不满足而造成的部分母本自交结实所带来的纯度超标问题)，制备的水稻种子产品成苗纯度非常高，至少能够达到98％以上。因此，本发明提供的水稻种子产品及其制备方法能够彻底解决因为种子纯度不达标而导致的巨大经济损失问题。
此外，本发明提供的大田种植的含抗除草剂基因的水稻种子(不含除草剂)的另一个特点是：在水稻三到四叶期的时候喷施除草剂也能够杀死杂株，但杂株要在喷施除草剂后三周左右才能完全枯死，如果农户忘记喷施或者喷施剂量及方法不正确造成杂株不完全死亡这都会给农业生产带来了很大的不利影响，也会对环境造成一定的污染：而采用本发明的水稻种子产品，种子按常规播种后，不需要农户采取任何措施，水稻杂株不能成苗，彻底解决种子纯度不达标而导致的巨大经济损失问题；因为采用本发明的水稻种子产品含除草剂量很少(所述除草剂的重量比是80-1600:1，优选为500-1000:1。)可以减少对环境的污染。
具体实施方式
本发明提供了一种大田种植的含抗除草剂基因的水稻种子产品，该水稻种子产品包括含抗除草剂基因的水稻种子和所述含抗除草剂基因的水稻种子能够抵抗的除草剂。
本发明提供的大田种植的含抗除草剂基因的水稻种子产品能够保证按常规正常播种不采取其他任何措施的情况下种子成苗纯度至少高于98％，从而大大降低了因为种子纯度不达标而导致的巨大经济损失。
所述含抗除草剂基因的水稻种子和所述含抗除草剂基因的水稻种子能够抵抗的除草剂的比例没有特别限制，只要所述除草剂的浓度(或含量)能够满足在育秧(或大田种植)期间杀死不含抗除草剂基因的水稻种子长出的青苗。
但是，为了尽可能杀死所有不含抗除草剂基因的水稻种子长出的青苗，在一种优选的实施方式中，所述含抗除草剂基因的水稻种子和所述除草剂的重量比是80-1600:1；为了保证除草剂选择效果以及尽可能减少环境污染，优选地为所述含抗除草剂基因的水稻种子和所述除草剂的重量比500-1000：1。
本申请中，所述水稻种子产品的形式没有特别的限制，在一种优选的实施方式中，所述水稻种子产品为所述含抗除草剂基因的水稻种子和所述除草剂的混合物；或者所述水稻种子产品为所述除草剂的包衣剂包被的所述抗除草剂基因的水稻种子的形式；或者所述水稻种子产品为所述除草剂的丸粒化剂包被的所述抗除草剂基因的水稻种子的丸粒。
本申请中，所述抗除草剂没有特别的限制，只要满足含有所述抗除草剂的水稻对所述除草剂具有抵抗性，在一种优选的实施方式中，所述抗除草剂为三氮苯类除草剂、腈类除草剂、吡啶类除草剂、环状亚胺类除草剂、磺酰胺类除草剂、咪唑啉酮类除草剂、磺酰脲类除草剂、三唑嘧啶类除草剂和嘧啶水杨酸类除草剂；优选为咪唑啉酮类除草剂、磺酰脲类除草剂、三唑嘧啶类除草剂和嘧啶水杨酸类除草剂；最优选为咪唑啉酮类除草剂，例如灭草烟、普杀特、百垄通。
在一种优选的实施方式中，所述含抗除草剂基因的水稻种子通过以下步骤制备：
(1)将恢复系或者父本与含抗除草剂基因的水稻育种材料杂交；
(2)将步骤(1)获得的水稻种子自交一次或多次，或者与所述恢复系或者父本回交一次或多次，或者与其它品种杂交一次或者多次；以及
(3)将步骤(2)获得的含抗除草剂基因的品系与三系或者两系不育系进行杂交，获得含抗除草剂基因的水稻种子。
为了提高大田用水稻种子的纯度，在一种优选的实施方式中，在进行步骤(1)之前，用含有所述含抗除草剂基因的水稻育种材料能够抵抗的除草剂的包衣剂对含抗除草剂基因的水稻育种材料进行包衣；或者将所述含抗除草剂基因的水稻育种材料能够抵抗的除草剂与含抗除草剂基因的水稻育种材料进行拌种；或者用含有一定浓度的所述含抗除草剂基因的水稻育种材料能够抵抗的除草剂溶液对所述含抗除草剂基因的水稻育种材料进行浸泡；或者对含抗除草剂基因的水稻育种材料的秧苗喷施含有所述含抗除草剂基因的水稻育种材料能够抵抗的除草剂。从而除去混杂的不含抗除草剂基因的水稻。
所述含抗除草剂基因的水稻育种材料可以是非转基因的或者转基因的，具体可以是美国氰胺公司培育的抗除草剂水稻pt2，江苏省农业科学院培育的抗除草剂水稻，深圳兴旺生物种业有限公司培育的抗除草剂水稻，或者含有bar基因的水稻。但在一种优选的实施方式中，所述含抗除草剂基因的水稻育种材料是非转基因的水稻育种材料，具体可以是美国氰胺公司培育的抗除草剂水稻pt2，江苏省农业科学院培育的抗除草剂水稻，深圳兴旺生物种业有限公司培育的抗除草剂水稻。
本发明还提供一种大田种植的含抗除草剂基因的水稻种子产品的制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)将恢复系或者父本与含抗除草剂基因的水稻育种材料杂交；
(2)将步骤(1)获得的水稻种子自交一次或多次，或者与所述恢复系或者父本回交一次或多次，或者与其它品种杂交一次或者多次；以及
(3)将步骤(2)获得的含抗除草剂基因的品系与三系或者两系不育系进行杂交，获得含抗除草剂基因的水稻种子；
(4)用步骤(3)获得的含抗除草剂基因的水稻种子能够抵抗的除草剂处理步骤(3)获得的含抗除草剂基因的水稻种子。
在步骤(4)中，所述含抗除草剂基因的水稻种子和所述含抗除草剂基因的水稻种子能够抵抗的除草剂的比例没有特别限制，只要所述除草剂的浓度(或含量)能够满足杀死育秧(或大田种植)期间不含抗除草剂基因的水稻种子长出的青苗。但是，为了尽可能杀死所有不含抗除草剂基因的水稻种子长出的青苗，在一种优选的实施方式中，所述含抗除草剂基因的水稻种子和所述除草剂的重量比是80-1600:1；为了保证除草剂选择效果以及尽可能减少环境污染，优选地为所述含抗除草剂基因的水稻种子和所述除草剂的重量比500-1000：1。
为了尽可能提高大田种子成苗的品系纯度，在一种优选的实施方式中，在步骤(4)中：将所述含抗除草剂基因的水稻种子和所述除草剂进行拌种；或者用所述除草剂的包衣剂包被所述抗除草剂基因的水稻种子；或者用所述除草剂的丸粒化剂包被所述抗除草剂基因的水稻种子。这样处理后的大田用的水稻种子，能够在育秧(或大田种植)期间尽可能杀死所有不含抗除草剂基因的水稻青苗。
为了提高大田用水稻种子的纯度，在一种优选的实施方式中，在进行步骤(1)之前，用含有所述含抗除草剂基因的水稻育种材料能够抵抗的除草剂的包衣剂对含抗除草剂基因的水稻育种材料进行包衣；或者将含有所述含抗除草剂基因的水稻育种材料能够抵抗的除草剂与含抗除草剂基因的水稻育种材料进行拌种；或者用含有一定浓度的所述含抗除草剂基因的水稻育种材料能够抵抗的除草剂溶液对所述含抗除草剂基因的水稻育种材料进行浸泡；或者对含抗除草剂基因的水稻育种材料的秧苗喷施含有所述含抗除草剂基因的水稻育种材料能够抵抗的除草剂。从而除去混杂的不含抗除草剂基因的水稻。
所述含抗除草剂基因的水稻育种材料可以是非转基因的或者转基因的，具体可以是美国氰胺公司培育的抗除草剂水稻pt2，江苏省农业科学院培育的抗除草剂水稻，深圳兴旺生物种业有限公司培育的抗除草剂水稻，或者含有bar基因的水稻。但在一种优选的实施方式中，所述含抗除草剂基因的水稻育种材料是非转基因的水稻育种材料，具体可以是美国氰胺公司培育的抗除草剂水稻pt2，江苏省农业科学院培育的抗除草剂水稻，深圳兴旺生物种业有限公司培育的抗除草剂水稻。
本申请中，所述抗除草剂没有特别的限制，只要满足含有所述抗除草剂的水稻对所述除草剂具有抵抗性，在一种优选的实施方式中，所述抗除草剂为三氮苯类除草剂、腈类除草剂、吡啶类除草剂、环状亚胺类除草剂、磺酰胺类除草剂、咪唑啉酮类除草剂、磺酰脲类除草剂、三唑嘧啶类除草剂和嘧啶水杨酸类除草剂；优选为咪唑啉酮类除草剂、磺酰脲类除草剂、三唑嘧啶类除草剂和嘧啶水杨酸类除草剂；最优选为咪唑啉酮类除草剂，例如灭草烟、普杀特、百垄通。
实施例
实施例1两系杂交制种
(1)以雅恢2115(从四川农业大学引进)和含有抗除草剂基因的黄华占(深圳市作物分子设计育种研究院)配制杂交组合。播种雅恢2115和含有抗除草剂基因的黄华占，对3-4叶期的含有抗除草剂基因的黄华占喷施百垄通(浓度0.4体积％)，杂交制得f1代。
(2)将f1代与雅恢2115回交直到获得遗传性状稳定的含抗除草剂基因的bc2代。
(3)将bc2代与两系不育系y58s(从湖南杂交水稻研究中心引进)进行杂交，获得含有抗除草剂的大田种植的水稻种子。
(4)用百垄通与步骤(3)获得的大田种植的水稻种子进行拌种，其中，百垄通与大田种植的水稻种子的重量比为1：1000(每公斤种子用百垄通((有效成分：240g/l甲咪唑烟酸水剂))((4.17ml)+自来水(21ml))进行拌种。
种子纯度和青苗纯度的检测：
将实施例1步骤(3)中获得的大田种植的水稻种子取600粒平均分成a和b两组，从实施例1步骤(4)中获得的大田种植的水稻种子产品取300粒，形成c组。按常规催芽后单粒播种，a组在3叶期喷施除草剂(浓度0.4体积％)，b组3叶期喷施清水。第一次在秧苗3叶期计数成苗的数量，在第一次计数后20天进行第二次计数成苗的数量，第三次在抽穗杨花期计数杂株的类型和数量。结果如下：
结论：1、a组和b组的种子田间发芽率(成苗率)达97.3％(国家标准为≥80％)，c组的种子田间发芽率(成苗率)为93.7％。
2、由步骤(3)提供的种子纯度为96.2％(国家标准为≥96％)，在3叶期不喷施除草剂，由步骤(3)提供的种子获得的青苗纯度为96.2％；在3叶期喷施除草剂，由步骤(3)提供的种子获得的青苗纯度为100％。
3、由步骤(4)提供的种子产品和青苗纯度为100％(国家标准为≥96％)。
另外，步骤(3)获得的种子喷施除草剂后，杂株要在播种后40天左右才死亡(出苗后死亡)；如果农户忘记喷施或者喷施剂量及方法不正确照成杂株不完全死亡这都会给农业生产带来了很大的不利影响也会对环境造成一定的污染：而步骤(4)获得的种子产品按常规播种后杂株全部死亡(不出苗)。因此，采用本发明提供的种子产品和青苗纯度高，土地利用率高，对环境污染少
实施例2两系杂交制种
以雅恢2115(从四川农业大学引进)和含有抗除草剂基因的黄华占(深圳市作物分子设计育种研究院)配制杂交组合。用含有浓度0.2体积％的百垄通浸泡含有抗除草剂基因的黄华占24小时，播种雅恢2115和用灭草烟浸泡后的含有抗除草剂基因的黄华占，杂交制得f1代。
(2)将f1代与雅恢2115回交直到获得遗传性状稳定的含抗除草剂基因的bc2代。(3)将bc2代与两系不育系y58s(从湖南杂交水稻研究中心引进)进行杂交，获得含有抗除草剂的大田种植的水稻种子。
(4)用含有百垄通的包衣剂包被步骤(3)获得的大田种植的水稻种子，其中，百垄通与大田种植的水稻种子的重量比为1：1600。
其中，包衣剂的制备过程如下：对于一公斤种子，将2.5ml成膜剂(由中化作物保护品有限公司提供)，2.1ml除草剂(240g/l甲咪唑烟酸水剂)和21ml自来水混合均匀即可。
种子纯度和青苗纯度的检测：
将实施例2步骤(3)中获得的大田种植的水稻种子取600粒平均分成a和b两组，从实施例2步骤(4)中获得的大田种植的水稻种子产品取300粒，形成c组。按常规催芽后单粒播种，a组在3叶期喷施除草剂(浓度0.4体积％)，b组3叶期喷施清水。第一次在秧苗3叶期计数成苗的数量，在第一次计数后20天进行第二次计数成苗的数量，第三次在抽穗杨花期计数杂株的数量。结果如下：
结论：1、a组和b组的种子田间发芽率(成苗率)达94.7％(国家标准为≥80％)，c组的种子田间发芽率(成苗率)为88.3％；
2、由步骤(3)提供的种子纯度为93.3％(国家标准为≥96％)，在3叶期不喷施除草剂，由步骤(3)提供的种子获得的青苗纯度为93.3％；在3叶期喷施除草剂，由步骤(3)提供的种子获得的青苗纯度为100％。
3、由步骤(4)提供的种子产品和青苗纯度为100％(国家标准为≥96％)
另外，步骤(3)获得的种子喷施除草剂后，杂株要在播种后40天左右才死亡(出苗后死亡)；如果农户忘记喷施或者喷施剂量及方法不正确照成杂株不完全死亡这都会给农业生产带来了很大的不利影响也会对环境造成一定的污染：而步骤(4)获得的种子产品按常规播种后杂株全部死亡(不出苗)。因此，采用本发明提供的种子产品和青苗纯度高，土地利用率高。对环境污染少。
实施例3两系杂交制种
(1)以雅恢2115(从四川农业大学引进)和含有抗除草剂基因的黄华占(深圳市作物分子设计育种研究院)配制杂交组合，用百垄通与含有抗除草剂基因的黄华占混合拌种(每公斤种子用百垄通((有效成分：240g/l甲咪唑烟酸水剂))((13.9ml)+水(21ml))，播种雅恢2115和用灭草混合拌种后的含有抗除草剂基因的黄华占，杂交制得f1代。
(2)将f1代与雅恢2115回交直到获得遗传性状稳定的含抗除草剂基因的bc2代。
(3)将bc2代与两系不育系y58s(从湖南杂交水稻研究中心引进)进行杂交，获得含有抗除草剂的大田种植的水稻种子。
(4)用百垄通与步骤(3)获得的大田种植的水稻种子进行拌种，其中，百垄通与大田种植的水稻种子的重量比为1：300(每公斤种子用百垄通((有效成分：240g/l甲咪唑烟酸水剂))((13.9ml)+自来水(21ml))进行拌种。
种子纯度和青苗纯度的检测：
将实施例3步骤(3)中获得的大田种植的水稻种子取600粒平均分成a和b两组，从实施例3步骤(4)中获得的大田种植的水稻种子产品取300粒，形成c组。按常规催芽后单粒播种，a组在3叶期喷施除草剂(浓度0.4体积％)，b组3叶期喷施清水。第一次在秧苗3叶期计数成苗的数量，在第一次计数后20天进行第二次计数成苗的数量，第三次在抽穗杨花期计数杂株的数量。结果如下：
结论：1、a组和b组的种子田间发芽率(成苗率)达92.7％(国家标准为≥80％)，c组的种子田间发芽率(成苗率)为82.6％。
2、由步骤(3)提供的种子纯度为89.2％(国家标准为≥96％)，在3叶期不喷施除草剂，由步骤(3)提供的种子获得的青苗纯度为89.2％；在3叶期喷施除草剂，由步骤(3)提供的种子获得的青苗纯度为99.3％。
3、由步骤(4)提供的种子产品和青苗纯度为100％(国家标准为≥96％)
另外，步骤(3)获得的种子喷施除草剂后，杂株要在播种后40天左右才死亡(出苗后死亡)；如果农户忘记喷施或者喷施剂量及方法不正确照成杂株不完全死亡这都会给农业生产带来了很大的不利影响也会对环境造成一定的污染；而步骤(4)获得的种子产品按常规播种后杂株全部死亡(不出苗)。因此，采用本发明提供的种子产品和青苗纯度高，土地利用率高，对环境污染少。
实施例4三系杂交制种
(1)以r198(商购，四川正兴种业有限公司)和含有抗除草剂基因的黄华占(深圳市作物分子设计育种研究院)配制杂交组合。播种r198和含有抗除草剂基因的黄华占，对3-4叶期的含有抗除草剂基因的黄华占喷施灭草烟(浓度0.4体积％)，杂交制得f1代。
(2)将f1代与r198回交直到获得遗传性状稳定的含抗除草剂基因的bc2代。
(3)将bc2代与三系不育系龙1a(从四川奥力星农业科技有限公司引进)进行杂交，获得含有抗除草剂的大田种植的水稻种子。
(4)用灭草烟与步骤(3)获得的大田种植的水稻种子进行拌种，其中，灭草烟与大田种植的水稻种子的重量比为1：500(每公斤种子用灭草烟((3-吡啶羧酸-2-[4,5-二氢-4-甲基-4-(1-甲基乙基)-5-氧-1h-咪唑-2-基]酯，cas号81334-34-1)水剂(浓度为0.345％)))((5.8ml)+自来水(21ml))。
种子纯度和青苗纯度的检测：
将实施例4步骤(3)中获得的大田种植的水稻种子取600粒平均分成a和b两组，从实施例4步骤(4)中获得的大田种植的水稻种子产品取300粒，形成c组。按常规催芽后单粒播种，a组在3叶期喷施除草剂(浓度0.4体积％)，b组3叶期喷施清水。第一次在秧苗3叶期计数成苗的数量，在第一次计数后20天进行第二次计数成苗的数量，第三次在抽穗杨花期计数杂株的数量。结果如下：
结论：1、a组和b组的种子田间发芽率(成苗率)达93.3％(国家标准为≥80％)，c组的种子田间发芽率(成苗率)为85％。
2、由步骤(3)提供的种子纯度为91％(国家标准为≥96％)，在3叶期不喷施除草剂，由步骤(3)提供的种子获得的青苗纯度为91％；在3叶期喷施除草剂，由步骤(3)提供的种子获得的青苗纯度为99.6％。
3、由步骤(4)提供的种子产品和青苗纯度为100％(国家标准为≥96％)
另外，步骤(3)获得的种子喷施除草剂后，杂株要在播种后40天左右才死亡(出苗后死亡)；如果农户忘记喷施或者喷施剂量及方法不正确照成杂株不完全死亡这都会给农业生产带来了很大的不利影响也会对环境造成一定的污染；而步骤(4)获得的种子产品按常规播种后杂株全部死亡(不出苗)。因此，采用本发明提供的种子产品和青苗纯度高，土地利用率高。对环境污染少。