本发明涉及食用菌培养技术领域，尤其是涉及一种黑牛肝菌的液体菌种培养方法及栽培方法。
背景技术
黑牛肝菌phlebopusportentosus(berk&broome)boedijn，又名暗黑网柄牛肝菌，隶属于牛肝菌目小牛肝菌科(boletinellaceae)，味道鲜美、营养丰富，其水提物具有抗癌抗病毒作用，且含有丰富的矿质元素及多种人体必需氨基酸中，因其兼具食用及药用价值而深受消费者喜受爱，自然采摘数量极少，不能满足市场需求，现有技术已完成黑肝菌工厂化栽培技术模式，且工厂化栽培是必然趋势。然而，黑牛肝菌固体菌种培养周期长，因固体菌种隐形污染而带来的养菌期大量污染难于控制。目前，牛肝菌液体菌种均以三角瓶摇瓶培养为主，三角瓶摇瓶培养的液体菌种菌球获得效率低，不能进行机械接种，目前依靠人工接种，无法适用于工厂化规模栽培。
发酵罐培养技术具有生产周期短、菌龄一致、菌种成本低等优点，可进行机械接种，然而黑牛肝菌的发酵罐培养技术鲜有报道。
有鉴于此，特提出本发明。
技术实现要素：
本发明的第一目的在于提供一种黑牛肝菌的液体菌种培养方法，该方法探索了黑牛肝菌液体菌种在发酵罐中培养条件，为机械化接种提供了可行性，既比现有的三角瓶培养方法的生产效率高，又比固体菌种培养法的污染率低。
本发明的第二目的在于提供一种黑牛肝菌的栽培方法，该方法具有生产效率高、污染率低、流程简单、成本低等优点。
为了实现以上目的，本发明提供了以下技术方案：
一种黑牛肝菌的液体菌种培养方法，包括下列步骤：
将黑牛肝菌的液体菌种接种于发酵罐中，经过菌种菌丝破碎、菌丝恢复、培养适应萌发、菌丝生长、菌丝倍数增长期、接种养菌前适应期六个阶段的培养后，完成发酵；
其中，所述菌种菌丝破碎的培养条件为：培养温度15-17℃，通气压力0.01-0.04mpa，通气0.5-1h后停止通气，再在4500-5500r/min的搅拌速度、15-17℃下培养2-3h；
所述菌丝恢复的培养条件为：培养温度22-24℃，在搅拌速度450-650r/min、通气压力0.02-0.06mpa下培养8-12h；
所述培养适应萌发的培养条件为：温度27.5-31.5℃，通气压力为0.04-0.08mpa，转速400-550r/min，培养20-26h；
所述菌丝生长的培养条件为：温度27.5-31.5℃、通气压力0.02-0.04mpa、搅拌速度2000-2500r/min的条件下培养2-6h；然后在温度27.5-31.5℃、通气压力0.08-0.12mpa、搅拌速度800-1000r/min的条件下培养24h-30h；
所述菌丝倍数增长期的培养条件为：温度27.5-31.5℃，调节通气压力0.1-0.15mpa，培养24-30h；
所述接种养菌前适应期的培养条件为：温度13-17℃，通气压力0.1-0.15mpa培养20-24h，并且在此期间间歇补光。
通常液体菌种的培养有缓滞期、指数生长期、稳定期和衰亡期四个生长阶段，但现有的固体菌种培养方法或者三角瓶培养方法并没有对黑牛肝菌的四个阶段的培养条件作区别化处理，并且其培养方法并不通用于大容量的培养，不适用于发酵罐培养。
为此，本发明对液体菌种在发酵罐中的培养条件作了如上优化。本发明将液体菌种在发酵罐中的生长分为了六个阶段，针对不同阶段细菌的生长特点制定了不同的培养条件，从而使黑牛肝菌适宜发酵罐中的生长，并获得较高的生长速率。与固体菌种培养相比，本发明的液体菌种培养周期缩短了10～15天。同时，与三角瓶培养法相比，本发明适宜机械接种，简化了流程，提高了生产效率。
本发明主要通过控制温度、通气量、搅拌速度(即剪切力)、培养时间来控制六个阶段的生长情况。而且部分阶段的培养分两步，例如菌丝破碎期和菌丝生长期。本发明的培养方法适宜于任意容量的发酵罐，尤其是应用较多的350l-1000l的发酵罐。
以上培养方法还可以进一步改进，具体如下。
优选地，在所述菌丝倍数增长期，还向所述发酵罐中加入橡胶木的水煮液。
加入橡胶木的水煮液可以对菌种驯化，使其对覆土培养、出菇培养的环境适应力更强，提高出菇率。
优选地，所述橡胶木的水煮液通过以下方法获得：
用水煮沸堆料发酵40d-60d的橡木细锯末，煮沸30min以上，过滤，收集汁液。
优选地，每10g所述堆料发酵40d-60d的橡木细锯末中加入所述水1～2l。
优选地，所述橡胶木的水煮液的加入量为所述发酵罐中培养基的1wt％～3wt％。
优选地，所述菌丝倍数增长期不进行搅拌。
在菌丝倍数增长期不搅拌，减小剪切力，使细菌高速繁殖。
优选地，所述间歇补光的方法为：每间隔1h补光30min～40min。
优选地，所述接种养菌前适应期的发酵终点的生物量为10-15g/l。
此时发酵终止，预防菌种衰老退化，影响后续的接种、出菇。
优选地，所述发酵罐中的培养基的配方为：
优选地，所述发酵罐中的培养基的配方为：
以上培养基中的土豆和麦麸为固体原料的重量，但两者在加入培养基之前还需经过常规煮汁处理，也可采用本发明的煮汁处理，例如：准确称量药品，土豆清洗去皮，切成薄片后按需要量称取土豆，取干净煮汤锅炉加入所需营养液体积多2l水，放入称取好的土豆，加热煮沸至沸腾时加入用纱布包裹好的麦麸，浸汁至土豆变软，用500目筛孔的筛子过滤，得到土豆、麦麸汁。
黑牛杆菌完整的栽培方法还要在液体菌种培养完成后，进行接种培养、覆土、覆土层菌丝培养、出菇培养。
液体菌种培养方法采用上文所述的方法，以提高整体的生产效率，简化生产工艺。
接种培养、覆土、覆土层菌丝培养、出菇培养可采用常规的培养条件，也可采用本发明优化的条件，具体如下。
优选地，所述接种培养为：采用机器接种，再放入培养房，在28℃-33℃培养。
采用该条件培养后，菌的生长速率快，能很快长满菌瓶，并且对于相同容量菌瓶，本发明的菌种接种培养时间仅需要10-20d，比固体培养法节省了10～15天。
优选地，所述黑牛肝菌的液体菌种培养方法中，所述黑牛肝菌的液体菌种通过以下方法获得：
将活化的黑牛肝菌母种接种于三角瓶液体培养基中，然后转移至摇床培养，摇床转速为120-195r/min，温度25-35℃，培养8d～10d。
优选地，所述活化的方法为：将黑牛肝菌母种接种于试管斜面培养基中，28℃-30℃培养30～35天，菌丝长满斜面，完成母种活化。
优选地，所述试管斜面培养基和所述三角瓶液体培养基的配方为：
优选地，所述试管斜面培养基和所述三角瓶液体培养基的配方为：
以上培养基中的土豆为固体原料的重量，但在加入培养基之前还需经过常规煮汁处理，也可采用本发明的煮汁处理，例如：准确称量上述药品，土豆清洗去皮，切成薄片后按需要量称取土豆，取干净铁盆加入所需营养液体积多200ml水，放入称取好的土豆，加热煮沸至土豆变软，用4层纱布过滤土豆煮汁。
在实际培养过程中，所述试管斜面培养基和所述三角瓶液体培养基可采用不同的配方，例如所述试管斜面培养基和所述三角瓶液体培养基中的一种采用以上配方即可。但通常为了提高效率，采用同样培养。
综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：
(1)探索了黑牛肝菌液体菌种在发酵罐中培养条件，为黑牛肝菌的机械化接种提供了可行性，既比现有的三角瓶培养方法的生产效率高，又比固体菌种培养法的污染率低；
(2)优化了液体菌种培养时的条件和培养基配方，进一步提高了菌种的生长速率；
(3)优化了母种活化、一级液体菌种的培养条件、接种培养条件、出菇培养条件等步骤，提高了黑牛肝菌栽培工艺的效率，为其工业化大规模生产提供了便利。
具体实施方式
下面将结合具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，但是本领域技术人员将会理解，下列所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
一、母种活化
母种活化培养基配方(简称m1)：
m1配制：准确称量上述药品，土豆清洗去皮，切成薄片后按需要量称取土豆，取干净铁盆加入所需营养液体积多200ml水，放入称取好的土豆，加热煮沸至土豆变软，用4层纱布过滤土豆煮汁，以过滤好的土豆煮汁溶解药品，定容分装于试管，115℃15min灭菌，穷然后摆成斜面，冷却备用。
母种活化
将保存的母种接种于上述⑵试管斜面培养基中，28℃培养30天，菌丝长满斜面，完成母种活化。
二、一级液体菌种培养
一级液体菌种培养培养配方及制备方法同上述⑴⑵，不同之处在于未加琼脂且将培养液分装于500m的锥形三角瓶，定容按400ml/瓶，灭菌115℃15min，冷却备用。
将上述活化的母种接种于三角瓶液体培养基中，6块/瓶，然后转移至摇床培养，摇床转速(120-195ramp/min),温度(25-35℃)培养8d，获得一级液体菌种。
三、液体菌种发酵培养
m2培养基制作：
准确称量药品，土豆清洗去皮，切成薄片后按需要量称取土豆，取干净煮汤锅炉加入所需营养液体积多2l水，放入称取好的土豆，加热煮沸至沸腾时加入用纱布包裹好的麦麸，浸汁至土豆变软，用500目筛孔的筛子过滤，得到土豆、麦麸汁；
橡胶木汁液：选取堆料发酵40d-60d的橡木细锯末，橡胶木粉准确称量，10g加水1l，煮沸30分钟，过滤除橡胶木锯末，得橡胶木汁液，该汁液在培养后期加入。
以上述a土豆、麦麸汁溶解其他药品，定容分装至容量350l发酵罐中，装液的发酵罐在灭菌锅中115℃、20min灭菌。
完成灭菌后的发酵罐移至冷却间接通通气阀通入无菌空气，冷水冲淋冷却20℃，次日接种。
液体菌种发酵培养：
发酵罐容量350l/罐，底部装有磁力搅拌机，采用磁力搅拌方法增加溶氧量。
①接种：选取上述1④获得的一级液体种，用75％的酒精表面，放入接种间备用；将发酵罐推入接种间，发酵罐的接种口以纯酒精点燃，灼烧3min以上消毒，然后打开发酵罐接种口的盖子，在火焰旁取下一级菌种瓶的塞子，将菌种快速接入发酵罐中，接种量5l/罐，接种完成关闭发酵罐接种口的盖子。
②培养：接种完成将发酵罐转移至培养间，接入通气阀和电机，按以下方法发酵培养：
(1)菌种(球)菌丝破碎，增加萌发点：调节培养温度15℃，通气压力0.01mpa，通气0.5h后停止通气，调节电机转速为4500ramp/min,培养2h。
(2)菌丝恢复：菌丝破碎后，调节适宜的中温(22℃)、中速(450ramp/min)及通气压力0.02mpa，培养8h让菌丝恢复。
(3)培养适应萌发：调节温度27.5℃，通气压力为0.04mpa，转速400/min，培养20h，让菌丝萌发；
(4)菌丝生长：调节温度27.5℃、调节通气压力0.02mpa、电机调节转速2000ramp/min、培养2h；调节通气压力0.08mpa，打开电机调节转速800ramp/min培养24h。
(5)进入倍数增长期，减小剪切力，接种前栽培基质适应：加入橡胶木煮汁1％，温度27.5℃，调节通气压力0.1mpa，关闭电机，培养24h；
(6)降低温度预防菌种衰老退化，接种养菌前适应：调节温度13℃，使用强光灯透过发酵罐观察玻璃口间歇补光。间隔1h一次每次30min，通气压力0.1mpa培养20h,发酵完成，发酵终点菌丝多，菌球细小，菌球均一，测量生物量，发酵终点生物量10-15g/l。
四、接种培养及出菇验证
发酵罐培养菌种完成后，采用机器接种。
放入培养房28℃-33℃培养10-20d,菌瓶长满，比固体菌种接种萌发快，菌瓶长满所需时间快于固体菌种接种10-15d。
菌瓶长满后采用机器覆土，覆土后菌丝生长快，菌丝浓密，菌丝生长优于固体菌种接种，覆土后培养8-12d，诱导出菇，出菇率为95.2-97.3％，出菇后培养3-4d完成采收。
采收后计算产量，平均菇重为93-121g/个。
实施例2-3
菌株活化、一级液体种培养、液体菌种发酵培养方法及出菇验证与实施例1相同，所不同的是：实施例2的发酵罐体积750l/罐，实施例3的发酵罐体积1000l/罐。发酵罐培养菌种完成后，采用机器接种。
实施例4
菌株活化、一级液体种培养、液体菌种发酵培养方法及出菇验证与实施例1相同，所不同的是液体菌种发酵培养条件：
(1)菌种(球)菌丝破碎，增加萌发点：调节培养温度16℃，通气压力0.025mpa，通气0.75h后停止通气，调节电机转速为5000ramp/min，培养2.5h。
(2)菌丝恢复：菌丝破碎后，调节适宜的中温(23℃)、中速(550ramp/min)及通气压力0.04mpa，培养10h让菌丝恢复。
(3)培养适应萌发：调节温度29.5℃，通气压力为0.06mpa，转速475/min，培养23h，让菌丝萌发；
(4)菌丝生长：调节温度29.5℃、调节通气压力0.03mpa、电机调节转速2250ramp/min、培养4h；调节通气压力0.1mpa，打开电机调节转速900ramp/min培养24h。
(5)进入倍数增长期，减小剪切力，接种前栽培基质适应：加入橡胶木煮汁2％，温度29.5℃，调节通气压力0.13mpa，关闭电机，培养27h；
(6)降低温度预防菌种衰老退化，接种养菌前适应：调节温度15℃，使用强光灯透过发酵罐观察玻璃口间歇补光。间隔1h一次每次30min，通气压力0.13mpa培养22h,发酵完成，发酵终点菌丝多，菌球细小，菌球均一，测量生物量，发酵终点生物量10-15g/l。
实施例5
菌株活化、一级液体种培养、液体菌种发酵培养方法及出菇验证与实施例1相同，所不同的是液体菌种发酵培养条件：
(1)菌种(球)菌丝破碎，增加萌发点：调节培养温度17℃，通气压力0.04mpa，通气1h后停止通气，调节电机转速为5500ramp/min，培养3h。
(2)菌丝恢复：菌丝破碎后，调节适宜的中温(24℃)、中速(650ramp/min)及通气压力0.08mpa，培养12h让菌丝恢复。
(3)培养适应萌发：调节温度31.5℃，通气压力为0.08mpa，转速550/min，培养26h，让菌丝萌发；
(4)菌丝生长：调节温度31.5℃、调节通气压力0.04mpa、电机调节转速2500ramp/min、培养6h；调节通气压力0.12mpa，打开电机调节转速1000ramp/min培养24h。
(5)进入倍数增长期，减小剪切力，接种前栽培基质适应：加入橡胶木煮汁3％，温度31.5℃，调节通气压力0.15mpa，关闭电机，培养30h；
(6)降低温度预防菌种衰老退化，接种养菌前适应：调节温度17℃，使用强光灯透过发酵罐观察玻璃口间歇补光。间隔1h一次每次30min，通气压力0.15mpa培养24h,发酵完成，发酵终点菌丝多，菌球细小，菌球均一，测量生物量，发酵终点生物量10-15g/l。
实施例6
菌株活化、一级液体种培养、液体菌种发酵培养方法及出菇验证与实施例1相同与实施例1相同，所不同的是培养基配方，如表1和表2。
表1m1的配方
表2m2的配方
实施例7
菌株活化、一级液体种培养、液体菌种发酵培养方法及出菇验证与实施例1相同，所不同的是培养基配方，如表3和4。
表3m1的配方
表4m2的配方
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。