本发明涉及植物种球组织保存
技术领域：
，尤其是一种百合种球组织的保存方法。
背景技术：
百合是百合科百合属的草本植物，为世界著名的球根花卉，具有花色丰富、姿态优美的特色。百合被广泛运用在园林布景、切花、鲜花和盆栽观赏等方面。中国作为百合分布中心，种质资源丰富，但多数野生种仍属于濒危植物。百合作为多年生球茎草本，不能通过低温种子库进行保存，目前主要的保存方式为田间种植保存，田间保存易在保存过程中出现褐变、腐烂，因此百合的中长期保存问题亟待解决。超低温保存是上世纪70年代发展起来的一项现代种质资源离体保存技术，通常在液氮中保存，被保存材料细胞内的物质代谢和生长活动几乎完全停止，处在相对稳定的生物学状态，达到长期保存种质的目的，如专利cn201410468249.5公开的一种提高百合胚性愈伤组织保存效果的方法，采用含有碳纳米材料的玻璃化溶液处理百合胚性愈伤组织以提高其保存效果；又如植物遗传资源学报2007.8(2)：170-173公开的“切花百合离体茎尖玻璃化法超低温保存研究”，超低温玻璃化法目前保存的都是离体植物愈伤组织或细胞。玻璃化法超低温保存是将细胞或组织置于由一定比例的渗透性和非渗透性保护剂组成的玻璃化溶液中，使材料及其玻璃化溶液在足够快的降温速率下固化成非结晶的玻璃化态，并以这种玻璃态在低温下保存。玻璃化法因操作简单快捷，成本低，适宜保存种类广泛，保存材料遗传性稳定，保存效果好等优点，但是不同的植株或细胞或组织其玻璃化溶液及外源物质的选择将直接影响植株的存活率和保存效果。技术实现要素：为解决上述技术问题，本发明提供了一种百合种球组织的保存方法，通过以下技术方案得以实现。一种百合种球组织的保存方法，包括如下步骤：1)预培养：将百合种球清洗干净，消毒，切片，裹上一层包衣后，置于冰桶中保存0.5～4小时；2)脱水：将百合种球组织转移至冷冻管中，室温下用玻璃化溶液处理20～35min，再用pvs2原液在0℃条件下处理10～50min；3)液氮保存：移去pvs2原液，用蜡块包封百合种球组织，密封在冷冻管内，直接投入液氮中冷冻保存；4)化冻：取出液氮中封存的百合种球组织，迅速化冻，除去表面石蜡层，用洗涤液洗涤2～3次，进行恢复培养。步骤(1)所述的包衣材料为云母、食品级明胶和水溶性壳聚糖的混合物，可使得百合种球形成表面膜层，提高百合种球的保鲜效果和成活率。进一步，所述的云母、食品级明胶和水溶性壳聚糖的混合物按10：(5～8)：3混合。步骤(2)的玻璃化溶液为浓度为60％的pvs2溶液。进一步，所述的60％的pvs2溶液为0.4mol/l蔗糖液体培养基与pvs2溶液按4：6所得混合液。进一步，所述的pvs2溶液组成为30％甘油、15％乙二醇、15％dmso、3％的蔗糖、3％淀粉和0.4mol/l抗冻糖蛋白。步骤(4)所述的百合化冻方法为将百合种球从液氮中取出，先水浴解冻，然后去除玻璃化溶液后用洗涤液洗涤，最后转入恢复培养基中恢复培养。进一步，所述水浴解冻的条件为在30～40℃的水浴中解冻60～120s。进一步，所述洗涤液为含有1.0～1.5mol/l蔗糖和5～10mmol/lkno3的ms培养液。进一步，所述的恢复培养为将步骤(4)所得百合种球组织置于固体培养基中，暗培养1周，光培养4周后，置于土壤或基质中种植。所述的暗培养是指在黑暗无光状态下培养；所述的光培养是指在阳光或日光灯下培养。所述的百合种球组织在液氮中封存的时间为1～365天。本发明的有益效果在于：本发明根据百合种球组织的物理形态，综合制定了百合种球组织的保存方法，包括百合种球组织的预培养、脱水方法和程度以及恢复培养等各个环节，本发明在预培养过程中将百合种球组织裹上一层包衣，与传统石灰包衣剂比较，本发明包衣剂透气性好，不影响种子呼吸，可有效延长百合种球组织贮藏期限而提高种球组织的抗逆性和成活率。本发明采用淀粉和抗冻糖蛋白作为外源物质加入至玻璃化溶液中使用，以防止百合种球细胞膜免受损伤，提高了百合种球组织的恢复生长率，本发明中公开的方法对百合种球组织的保存效果优化显著，对植物玻璃化超低温保存起到促进作用。具体实施方式下面进一步描述本发明的技术方案，但要求保护的范围并不局限于所述。本发明实施例中实验试剂的配方如下：1、玻璃化溶液为浓度为0.4mol/l蔗糖液体培养基与pvs2溶液按4：6所得混合液。2、pvs2溶液组成为30％甘油、15％乙二醇、15％dmso、3％的蔗糖。3、洗涤液为含有1.0～1.5mol/l蔗糖和5～10mmol/lkno3的ms培养液。实施例一种百合种球组织的保存方法，包括如下步骤：1)预培养：将百合种球清洗干净，切片，消毒，裹上一层云母混合物包衣，置于冰桶中保存0.5～4小时；2)脱水：将百合种球组织转移至冷冻管中，室温下用玻璃化溶液处理20～35min，再用pvs2原液在0℃条件下处理10～50min；3)液氮保存：移去pvs2原液，用蜡块包封百合种球组织，密封在冷冻管内，直接投入液氮中冷冻保存；4)化冻。所述的百合种球组织在液氮中封存的时间为24h。按照上述步骤将百合种球组织保存分为实验组和对照组。实验组1的包衣材料为云母、食品级明胶和水溶性壳聚糖按10：5：3的混合物，玻璃化溶液中含有3％淀粉；实验组2的包衣材料为云母、食品级明胶和水溶性壳聚糖按10：7：3的混合物，玻璃化溶液中含有0.4mol/l抗冻糖蛋白；实验组3的包衣材料为云母、食品级明胶和水溶性壳聚糖按10：8：3的混合物，玻璃化溶液中含有3％淀粉和0.4mol/l抗冻糖蛋白；对照组1：对照组不同之处在于包衣材料为云母、食品级明胶和水溶性壳聚糖按2：2：1的混合物，玻璃化溶液中不含有3％淀粉和0.4mol/l抗冻糖蛋白，其他与实验组相同；对照组2：对照组不同之处在于包衣材料为云母、食品级明胶和水溶性壳聚糖按3：8：3的混合物，预培养百合种球组织不进行云母混合物包衣，其他与实验组相同。将在液氮中冷冻保存24h的百合种球组织从液氮中取出，在30～40℃的水浴中解冻60～120s，然后去除玻璃化溶液后用洗涤液洗涤，将洗涤后的百合种球组织置于固体培养基中，暗培养1周，光培养4周后，置于土壤或基质中种植。计算并比较实验组和对照组内百合种球组织的相对成活率，见表1。表1实验组与对照组的百合种球组织的相对成活率组别实验组1实验组2实验组3对照组1对照组2成活率32.1％36.4％43.8％7.8％13.4％实验结果由表1可知，百合种球组织采用包衣进行预培养，玻璃化溶液中加入3％淀粉和0.4mol/l抗冻糖蛋白超低温保存可使百合种茎组织恢复生长率由7.8％提高到32.1％、36.4％和43.8％。其中，以同时添加淀粉和抗冻糖蛋白的提高效果最为显著。在试验组3的基础上，分别开展实验组4、实验组5、实验组6、实验组7。实验组4：在实验组3的基础上将百合种球组织在液氮中保存2天；实验组5：在实验组3的基础上将百合种球组织在液氮中保存60天；实验组6：在实验组3的基础上将百合种球组织在液氮中保存120天；实验组7：在实验组3的基础上将百合种球组织在液氮中保存365天；按实验组4～7的方法将百合种球组织在液氮中保存2天、60天、120天、365天后，再将百合种球组织从液氮中取出，在30～40℃的水浴中解冻60～120s，然后去除玻璃化溶液后用洗涤液洗涤，将洗涤后的百合种球组织置于固体培养基中，暗培养1周，光培养4周后，置于土壤或基质中种植。计算并比较各实验组百合种球组织的相对成活率，见表2。表2不同保存时间的百合种球组织相对成活率组别实验组4实验组5实验组6对照组7成活率44.1％43.9％43.6％43.5％从表2可知，百合种茎在液氮中冷冻保存的时间对百合种球组织相对成活率影响较小，农户可保存一年时间，在第二年再恢复培养种植。上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属
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中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。当前第1页12