本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种提高大叶金丝楸有效新梢分化数量的组织培养方法。
背景技术
楸树（catalpabungic.a.mey）是我国较为古老的树种之一，具有一系列优点，主要有：树干通直、树形美观、花色粉红特点；具有较强的消声、滞尘能力，对有害气体有较强的吸收作用；其自花授粉结实力差，没有落果污染环境，同时叶片落期集中，便于清扫；材质优良，加工应用领域广泛。金丝楸（catalpabungivar.）是楸树的一个地理变种，而大叶金丝楸则是从金丝楸实生后代群体中选育出来的一个优良无性系，与金丝楸相比，具有叶片大、生长速度快、材质优良等特点，既可营造速生丰产林，也可用作防护林，同时又是理想的农林间作树种，还是很好的城市绿化树种，集用材、防护、观赏、环保等多项功能于一体，应用前景非常广阔，在生产中需求旺盛。
楸树自古以来一直延用“取傍生者植之”的方法繁衍，进而逐渐形成了单一无性系，但由于这种繁殖方法的繁殖速度较慢，受限较多，因而使楸树的种植发展受到很大限制。为适应绿化栽培的大量需求，采用植物组织培养的方法快速繁殖大叶金丝楸种苗，是推广大叶金丝楸种植和满足市场需求的重要技术手段。
就植物组培快繁种苗生产而言，一般而言，不仅要有稳定的增殖系数能够继代扩繁，还要确保足够数量用于生根培养的有效新梢，才能使种苗生产顺利进行。而就金丝楸的组培技术研究而言，对现有采用单一培养基进行金丝楸增殖的技术（翟晓巧等，金丝楸茎段的组织培养及植株再生技术研究，河南农业大学学报，2002，36(4):319-321，培养基为wpm+iba0.3mg/l+6-ba5mg/l）研究后发现，由于培养基中含有较高浓度的6-ba（5mg/l），采用此方法进行大叶金丝楸组培快繁育苗时，随着继代次数的增加，组培苗容易出现愈伤组织大、苗矮小、玻璃化等问题，造成增殖不稳定，能够用于继代或生根培养的有效新梢分化数量少（如附图2所示），难以满足组培工厂化育苗生产要求。因此，建立一种操作简单、增殖稳定、获得有效新梢分化数量多的组培方法，对大叶金丝楸的种苗繁育及产业发展具有重要意义。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种两步接力增殖提高大叶金丝楸有效新梢分化数量的组织培养方法，从而为大叶金丝楸的组培体系的建立和种植推广奠定理论和应用基础。
本申请的主要技术方案详述如下。
一组用于提高大叶金丝楸有效新梢分化数量的组合培养基，该组合培养基用以提高组培过程中大叶金丝楸有效新梢分化数量，包括诱导培养基、分化培养基和生长培养基；
所述诱导培养基，ms（或wpm）培养基+蔗糖30g/l+琼脂6g/l+6-ba0.8mg/l+naa（iba或iaa）0.1mg/l；较优配方为：wpm培养基+蔗糖30g/l+琼脂6g/l+6-ba0.8mg/l+iba0.1mg/l；
所述分化培养基，wpm培养基+蔗糖30g/l+琼脂6g/l+6-ba0.6～3.0mg/l+iba0.1～0.3mg/l；较优配方为：wpm培养基+蔗糖30g/l+琼脂6g/l+6-ba1.0~2.0mg/l+iba0.1～0.2mg/l；最优配方为：wpm培养基+蔗糖30g/l+琼脂6g/l+6-ba2.0mg/l+iba0.1mg/l；
所述生长培养基，ms培养基+蔗糖30g/l+琼脂6g/l+6-ba0.8～1.0mg/l+iba0.1～0.5mg/l；较优配方为：ms培养基+蔗糖30g/l+琼脂6g/l+6-ba0.8mg/l+iba0.5mg/l。
所述用于提高大叶金丝楸有效新梢分化数量的组合培养基，还包括生根培养基，所述生根培养基，以ms为基本培养基，其中大量元素减半，附加iba0～0.8mg/l、naa0～0.5mg/l、活性炭（ac）0～1g/l、蔗糖20g/l、琼脂6g/l；
较优配方为：1/2ms培养基+iba0.8mg/l+naa0.08mg/l+活性炭（ac）0.5g/l+蔗糖20g/l+琼脂6g/l。
利用所述组合培养基的提高大叶金丝楸有效新梢分化数量的组织培养方法，包括如下步骤：
（1）建立无菌体系
采集大叶金丝楸外植体，灭菌后，采用诱导培养基培养形成不定芽，从而建成无菌体系；
所述诱导培养基以ms或wpm为基本培养基，额外加入：6-ba0.8mg/l，naa0.1mg/l（也可采用iba或iaa替代naa，替代后浓度相同），蔗糖30g/l和琼脂6g/l；
无菌体系构建过程中，培养条件要求为：温度23±2℃，光照强度2000lx，光照时间7h/d；
将消毒后外植体接种诱导培养基后，2～5d外植体开始萌动，培养12~15d左右形成不定芽，此时即可认为无菌株系已建成；
大叶金丝楸外植体的选择标准为：春季取大叶金丝楸生长健壮的新萌发枝条，剪去叶片，保留1cm左右叶柄，将此方式处理后的茎段作为外植体；
对外植体的具体消毒方式为：将外植体在自来水下冲洗1遍，再用肥皂水刷洗5～20min，然后自来水流水冲洗30min；
在超净工作台上，将外植体剪成长3～4cm、带1～3个腋芽的小茎段，用无菌水冲洗1遍后放入无菌组培瓶中，每瓶中放外植体约10个；75%酒精浸泡20s，无菌水冲洗1遍；0.1%升汞滴加1滴吐温80，灭菌8～12min；最后用无菌水冲洗4次，每次3～4min；
整个消毒灭菌过程中不断摇动无菌瓶，使消毒剂与外植体充分接触；
（2）两步接力方式继代培养
分切步骤（1）中诱导形成的不定芽，然后接种于第一步分化培养基中，培养10～20d，促使不定芽基部形成愈伤组织，并进一步分化形成不定芽丛；然后转接入第二步生长培养基，继续培养10～20d，以使丛生芽继续生长，并增加有效新梢数量，待所形成新梢高度不小于2cm时，进行后续诱导生根培养；而对高度不足2cm新梢及丛生芽继续进行上述两步接力方式的继代培养；
所述分化培养基，以wpm为基本培养基，附加6-ba0.6～3.0mg/l、iba0.1～0.3mg/l、蔗糖30g/l、琼脂6g/l；
所述生长培养基，以ms为基本培养基，附加6-ba0.8～1.0mg/l、iba0.1～0.5mg/l、蔗糖30g/l、琼脂6g/l，
继代培养过程中，培养条件为：温度23±2℃，光照强度2000lx，光照时间7h/d；
（3）诱导生根培养
切取步骤（2）中生长健壮且高度不小于2cm的新梢，接种到生根培养基上进行生根培养30d左右，以形成生根苗（在接种生根培养基后，一般7～10d时即可见根尖形成）；
所述生根培养基，以ms为基本培养基，其中大量元素减半，附加iba0～0.8mg/l、naa0～0.5mg/l、活性炭（ac）0～1g/l、蔗糖20g/l、琼脂6g/l，
生根培养过程中，培养条件为：培养温度25±2℃，光照强度2000lx，光照时间12h/d；
（4）炼苗、移栽
将步骤（3）中的生根幼苗置于温室中，敞开培养瓶口，炼苗5~10天左右（一般炼苗一周），然后将生根幼苗从培养瓶中取出，清水洗掉基部培养基，用有效成分含量50%的多菌灵800倍液浸泡1min，移栽入草炭：珍珠岩体积比为2:1的基质中；移栽初期扣小拱棚保湿，保证棚内湿度在95%以上，10d后逐渐掀开棚膜通风，正常管理即可。
本申请所提供大叶金丝楸组培方法，一方面通过培养基组分的优化调整，另一方面在继代培养过程中调整培养方式，通过采用两步接力的方式在特定培养基进行组培苗继代培养，在不延长总体培养时间的同时，兼顾了增殖与生长过程，增加了有效新梢数量，同时较好避免了组培过程中玻璃化现象发生。统计结果表明：与现有培养方式相比，同样组培时间内，本申请组培幼苗平均高度均在2.0cm以上，同时有效新梢数量比例稳定保持在75%左右，生根率大于80%，表现出较好的应用效果，也为大叶金丝楸的组培快繁规模化生产奠定了基础。
附图说明
图1为大叶金丝楸无菌体系建立后组培不定芽；
图2为大叶金丝楸常规培养方式的增殖新梢；
图3为采用本申请组培方法后大叶金丝楸的增殖新梢；
图4为采用本申请组培方法后大叶金丝楸的组培生根苗；
图5为采用本申请组培方法后大叶金丝楸的组培移栽苗。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。
实施例
本申请以大叶金丝楸为例，对本申请的组培方法、组培过程简要介绍如下。
（一）建立无菌体系
采集大叶金丝楸外植体，灭菌后，采用诱导培养基培养形成不定芽，从而建成无菌体系；
无菌体系构建过程中，培养条件要求为：温度23±2℃，光照强度2000lx，光照时间7h/d；
将消毒后外植体接种诱导培养基后，2～5d外植体开始萌动，培养12~15d左右形成不定芽，此时即可认为无菌株系已建成。
大叶金丝楸外植体的选择标准为：春季取大叶金丝楸生长健壮的新萌发枝条，剪去叶片，保留1cm左右叶柄，将此方式处理后茎段作为外植体；
对外植体的具体消毒方式为：将外植体在自来水下冲洗1遍，再用肥皂水刷洗10min左右，然后自来水流水冲洗30min；
在超净工作台上：将外植体剪成3～4cm、带1～3个腋芽的小茎段，用无菌水冲洗1遍后放入无菌组培瓶中，每瓶中放外植体约10个。75%酒精浸泡20s，无菌水冲洗1遍；0.1%升汞滴加1滴吐温80，灭菌8～12min；最后用无菌水冲洗4次，每次洗3～4min；
整个消毒灭菌过程中不断摇动无菌瓶，使消毒剂与外植体充分接触。
（1）关于灭菌时间的筛选、优化
需要说明的是，一般而言，不同外植体来源、不同灭菌时间对于后续无菌体系建立过程中的污染率、成芽率均有一定影响，为尽量减少灭菌时间对于污染率的影响，发明人主要对于灭菌（0.1%升汞的灭菌时间）时间进行了筛选优化。灭菌时间筛选过程中，实验方案及污染率结果如下表1所示。
表1，外植体灭菌时间筛选
从上表结果可以看出，春季采集的枝条幼嫩茎段灭菌10nin左右时，污染率最低，能够较好确保无菌体系的构建，因此后续实验均以灭菌10min的技术方案进行操作。
（2）关于诱导培养基的筛选、优化
为确定进一步诱导形成不定芽过程中的培养基配方，发明人进一步设计了不同类型诱导培养基，并进行了实际诱导实验，具体实验配方设计及诱导率结果如下表2所示。
表2，不同类型外植体诱导培养基及诱导率结果（表中数据均是培养15d左右数据，另外，表中wpm培养基、ms培养基均额外添加有蔗糖30g/l和琼脂6g/l）
从上表结果可以看出，基础培养基（基本培养基）采用wpm培养基时更适合大叶金丝楸的生长需求，而就具体激素类型选择而已，iba的诱导效果更优，因此，优化的诱导培养基配方为：以wpm为基本培养基，额外加入：6-ba0.8mg/l，iba0.1mg/l，蔗糖30g/l和琼脂6g/l；而后续实验，也以此优化培养基上所诱导培养形成的不定芽为基础进行后续继代培养。
（二）两步接力方式继代培养
分切步骤（1）中诱导形成的不定芽，然后接种于第一步分化培养基中，培养10d左右，促使不定芽基部形成愈伤组织，并进一步分化形成不定芽丛；然后转接入第二步生长培养基，继续培养20d左右，以使丛生芽继续生长，并增加有效新梢数量。待所形成新梢高度不小于2cm时，进行后续诱导生根培养；而对高度不足2cm幼苗及丛生芽继续进行上述两步接力方式的继代培养（可根据需要，仅采用第二步生长培养基延长培养时间以促进继续生长，或者分切后从第一步分化培养基重新开始培养）。
继代培养过程中，培养条件为：温度23±2℃，光照强度2000lx，光照时间7h/d。
需要说明的是，在诱导培养实验中，组培苗在wpm培养基诱导丛生芽多，但苗高较低，在ms培养基中丛生芽少，而苗高较高，因此在两步接力培养中，第一步继代培养时培养基以wpm为基本培养基（同时添加蔗糖30g/l、琼脂6g/l），第二步继代培养时培养基以ms为基本培养基（同时添加蔗糖30g/l、琼脂6g/l）。为确定继代培养过程中，分化培养基与生长培养基中激素的较优配方，发明人对于培养基中的激素浓度进行了进一步的筛选、优化，具体实验设计及实验结果列表如下。
对第一步继代培养过程中分化培养基实验设计及实验结果如下表3所示。
表3，第一步继代培养分化培养基的筛选（下述表格中数据是第一步分化培养基中培养10d后结果）
从上表统计结果可以看出，就分化培养基的设计而言，由于分化培养基设计的主要目的在于促进不定芽的分化，以形成更多的不定芽，同时保持分化苗的增殖稳定性，减少组培苗生长势弱、玻璃化等现象，因此以增殖系数较多、玻璃化苗比例少培养结果为优选结果，因此综合而言，分化培养基中较优的激素组合为：6-ba1.0~2.0mg/l+iba0.1mg/l，最佳组合为6-ba2.0mg/l+iba0.1mg/l，后续进一步的第二步的继代培养生长培养基筛选均是以此配方基础上所得实验材料进行实验。
对第二步继代培养过程中生长培养基的实验设计及实验结果如下表4所示。
表4，第二步继代培养生长培养基的筛选（表格中数据是采用第一步优化后分化培养基所育幼苗进一步在第二步分化培养基中培养20d后结果）
从上表统计结果可以看出，就生长培养基的设计而言，由于生长培养基的主要目的在于促进不定芽高度的快速生长，从而为后续生根移栽提供足够高度的新梢，因此主要考虑新梢生长高度，同时为确保能够满足生根培养的新梢数量需要，，应兼顾考虑大于2cm的新梢所占比例，因此综合而言，生长培养基中较优激素组合配方为：6-ba0.8mg/l+iba0.5mg/l。
综上所述，继代培养过程中较优的培养基组合为：
分化培养基，以wpm为基本培养基，附加：6-ba2.0mg/l、iba0.1mg/l、蔗糖30g/l、琼脂6g/l；
生长培养基，以ms为基本培养基，附加：6-ba0.8mg/l、iba0.5mg/l、蔗糖30g/l、琼脂6g/l。
（三）诱导生根培养
以步骤（二）中优化后培养基中生长新梢为实验材料，切取生长健壮且高度不小于2cm的新梢接种到生根培养基上进行生根培养30d，以形成生根苗（生根过程中，在接种生根培养基后，一般7～10d时即可见根尖形成）；
生根培养过程中，培养条件为：培养温度25±2℃，光照强度2000lx，光照时间12h/d。
为确定生根过程中生根培养基中激素的较优组合，发明人以ms为基本培养基，其中大量元素减半，同时添加蔗糖20g/l、琼脂6g/l，然后对生根培养基中激素用量进行了筛选、优化，具体实验设计及统计结果如下表所示。
表5，生根诱导培养基筛选（表中数据是生根诱导培养30d的统计结果）
对上表数据分析可以看出，生根培养基中活性炭（ac）的使用对于提高生根效果具有较为突出的影响，而综合而言，较优的生根培养基应当设计为：
生根培养基，以ms为基本培养基，其中大量元素减半，附加iba0.8mg/l、naa0.08mg/l、活性炭（ac）0.5g/l、蔗糖20g/l、琼脂6g/l。
（四）炼苗、移栽
以步骤（三）中优化的生根培养基所育生根幼苗为实验材料。将生根培养30d的培养瓶置于温室中，敞开瓶口，炼苗7天左右。然后将生根幼苗从培养瓶中取出，清水洗掉基部培养基，用有效成分含量50%多菌灵800倍液浸泡1min，移栽入草炭：珍珠岩体积比为2:1的基质中；移栽初期扣小拱棚保湿，保证棚内湿度在95%以上，10d后逐渐掀开棚膜通风，正常管理。统计结果表明：移栽成活率在85%以上，表现出较好的应用前景。
对组培过程中不同培养阶段组培幼苗进行观察，部分实际培养情况如附图所示，其中图1为接种外植体后所形成的大叶金丝楸无菌体系，从图中可以看出，不定芽萌发形成数量较多，可为后续组培奠定基础。图2为现有常规组培方式（培养基为wpm+iba0.3mg/l+6-ba5mg/l）所形成的增殖新梢，观察可以看出，未经培养基优化时，组培苗存在愈伤组织大、新梢短小、玻璃化等现象，且较为明显和突出。图3为两步接力继代培养后增殖新梢，可以看出，新梢较高，且生长状态较为一致。图4为诱导生根后组培幼苗，可以看出生根效果较好。图5为移栽后大棚内幼苗，可以看出，幼苗生长较为健壮，且成活率较高，表现出较好的应用前景。