本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种利用紧穗野生稻根为外植体获得组培苗的方法。
背景技术
野生稻资源是水稻育种中获得有利外源基因的一个重要来源。紧穗野生稻（oryzaeichingeri）原产于非洲，斯里南卡，具有cc染色体组，与栽培稻亲缘关系较远，并具有许多优良特性，如抗虫、抗病、抗旱、植株高大、功能叶片耐衰老、良好生长优势等。
目前，紧穗野生稻的繁殖手段主要是茎干扦插和分根移栽，以及种子繁殖，利用茎干扦插和分根移栽繁殖紧穗野生稻后代，繁殖过程繁琐、繁殖率低、时间长；利用种子进行繁殖，种子落粒性强，种子品质较差，种子萌发率较低，这样严重妨碍了紧穗野生稻的保存、保护和利用。为了更多、更好、更快地获得紧穗野生稻后代，开发一种拓宽紧穗野生稻繁殖范围的方法是非常必要的。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种利用紧穗野生稻根为外植体获得组培苗的方法。
本发明的目的是这样实现的，包括前处理、诱导培养、增殖培养、分化培养、壮苗培养、生根培养和炼苗移栽步骤，具体包括：
a、前处理：选择2~3月份往年的稻莊刚冒新芽植株连根拔起，清洗灭菌的带稻根备用；
b、诱导培养：将前处理后的稻根切成0.8~1.0cm长，接种到诱导培养基上，于温度25~30℃下暗培养20~40天，更换诱导培养基一次，再培养5~15天得到诱导愈伤组织；
c、增殖培养：将诱导愈伤组织切成0.4~0.6cm接入增殖培养基中，于温度25~30℃暗培养25~30天，更换增殖培养基一次，继续培养20~40天得到增殖愈伤组织；
d、分化培养：将增殖愈伤组织接入分化培养基中，于温度25~30℃、光照为1500~2500lx下进行光照培养25~35天后，得到分化愈伤组织；
e、继代培养：将分化愈伤组织接入继代培养基中，于温度25~30℃、光照为1500~2500lx下进行光照培养15~20天至愈伤组织出现淡绿点，继续培养10~25天得到独立小苗；
f、壮苗培养：将小苗接入壮苗培养基中，于温度25~30℃、光照为2500~3500lx下进行光照培养30~35天得到健壮无根苗；
g、生根培养：将健壮无根苗接入生根培养基中，于温度25~30℃、光照为2500~3500lx下进行光照培养5~20天得到生根苗；
h、炼苗移栽：将生根苗的根部培养基冲洗干净，加水淹没根部，于温度25~30℃、光照为1500~2500lx下过渡培养2~4天，再加入腐殖土继续培养5~15天至长出新根，即移栽至大田中；
其中，所述的诱导培养基为：ms4.0~5.0g/l+2,4-d8~12mg/l+琼脂粉8~10g/l+蔗糖20~40g/l，ph5.0~7.0；
所述的增殖培养基为：ms4.0~5.0g/l+2,4-d8~12mg/l+琼脂粉8~10g/l+蔗糖20~40g/l，ph5.0~7.0；
所述的分化培养基为：ms4.0~5.0g/l+6-ba6mg/l+zt3~5mg/l+naa0.02~0.04mg/l+琼脂粉8~10g/l+蔗糖20~40g/l，ph5.0~7.0；
所述的继代培养基为：ms4.0~5.0g/l+6-ba6mg/l+zt3~5mg/l+naa0.02~0.04mg/l+kt2~4mg/l+琼脂粉8~10g/l+蔗糖20~40g/l，ph5.0~7.0；
所述的壮苗培养基为：ms4.0~5.0g/l+6-ba6mg/l+tdz3~5mg/l+naa0.04~0.06mg/l+琼脂粉8~10g/l+蔗糖20~40g/l，ph5.0~7.0；
所述的生根培养基为：ms4.0~5.0g/l+naa0.02~0.04mg/l+琼脂粉8~10g/l+蔗糖10~20g/l，ph5.0~7.0。
本发明克服了对紧穗野生稻后代繁殖的不利因素，充分拓宽紧穗野生稻繁殖范围，多途径获得优质稳定的遗传后代，在不利因素与优良繁殖范围内，找到了新的技术研究契机。
本发明利用紧穗野生稻稻根作为外植体，采用清水清洗，用体积百分比为75%的酒精表面灭菌，再用体积百分比为0.1%的氯化汞灭菌，无菌水清洗后，接入愈伤诱导培养基上进行愈伤诱导培养，愈伤增殖，再接入分化培养基上进行分化培养，分化继代培养、壮苗培养、生根培养，炼苗最后移栽大田收获种子。在愈伤诱导、愈伤增殖、分化培养、分化继代培养、壮苗培养以及生根培养过程中运用不同的植物激素组合以及最适合的体积搭配，不同培养时期采用不断改变的培养技术条件，成功的利用紧穗野生稻稻根作为外植体诱导出愈伤组织并获得组培苗。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
本发明所述的利用紧穗野生稻根为外植体获得组培苗的方法，包括前处理、诱导培养、增殖培养、分化培养、壮苗培养、生根培养和炼苗移栽步骤，具体包括：
a、前处理：选择2~3月份往年的稻莊刚冒新芽植株连根拔起，清洗灭菌的带稻根备用；
b、诱导培养：将前处理后的稻根切成0.8~1.0cm长，接种到诱导培养基上，于温度25~30℃下暗培养20~40天，更换诱导培养基一次，再培养5~15天得到诱导愈伤组织；
c、增殖培养：将诱导愈伤组织切成0.4~0.6cm接入增殖培养基中，于温度25~30℃暗培养25~30天，更换增殖培养基一次，继续培养20~40天得到增殖愈伤组织；
d、分化培养：将增殖愈伤组织接入分化培养基中，于温度25~30℃、光照为1500~2500lx下进行光照培养25~35天后，得到分化愈伤组织；
e、继代培养：将分化愈伤组织接入继代培养基中，于温度25~30℃、光照为1500~2500lx下进行光照培养15~20天至愈伤组织出现淡绿点，继续培养10~25天得到独立小苗；
f、壮苗培养：将小苗接入壮苗培养基中，于温度25~30℃、光照为2500~3500lx下进行光照培养30~35天得到健壮无根苗；
g、生根培养：将健壮无根苗接入生根培养基中，于温度25~30℃、光照为2500~3500lx下进行光照培养5~20天得到生根苗；
h、炼苗移栽：将生根苗的根部培养基冲洗干净，加水淹没根部，于温度25~30℃、光照为1500~2500lx下过渡培养2~4天，再加入腐殖土继续培养5~15天至长出新根，即移栽至大田中；
其中，所述的诱导培养基为：ms4.0~5.0g/l+2,4-d8~12mg/l+琼脂粉8~10g/l+蔗糖20~40g/l，ph5.0~7.0；
所述的增殖培养基为：ms4.0~5.0g/l+2,4-d8~12mg/l+琼脂粉8~10g/l+蔗糖20~40g/l，ph5.0~7.0；
所述的分化培养基为：ms4.0~5.0g/l+6-ba6mg/l+zt3~5mg/l+naa0.02~0.04mg/l+琼脂粉8~10g/l+蔗糖20~40g/l，ph5.0~7.0；
所述的继代培养基为：ms4.0~5.0g/l+6-ba6mg/l+zt3~5mg/l+naa0.02~0.04mg/l+kt2~4mg/l+琼脂粉8~10g/l+蔗糖20~40g/l，ph5.0~7.0；
所述的壮苗培养基为：ms4.0~5.0g/l+6-ba6mg/l+tdz3~5mg/l+naa0.04~0.06mg/l+琼脂粉8~10g/l+蔗糖20~40g/l，ph5.0~7.0；
所述的生根培养基为：ms4.0~5.0g/l+naa0.02~0.04mg/l+琼脂粉8~10g/l+蔗糖10~20g/l，ph5.0~7.0。
a步骤中所述的清洗是用自来水冲洗掉根部淤泥，切下植株整株稻根，用无菌水冲洗2~4次。
a步骤中所述的灭菌是将待用的稻根放置在三角瓶中，加入0.1%的体积百分比氯化汞处理两次，时间分别是7~9min和5~7min，并不断摇动，倒掉，用无菌水洗6~8次，再用吸水纸将表面水吸干。
所述的诱导培养基为：ms4.43g/l+2,4-d10mg/l+琼脂粉9g/l+蔗糖30g/l，ph5.8。
所述的增殖培养基为：ms4.43g/l+2,4-d5mg/l+琼脂粉9g/l+蔗糖30g/l，ph5.8。
所述的分化培养基为：ms4.43g/l+6-ba6mg/l+zt4mg/l+naa0.03mg/l+琼脂粉9g/l+蔗糖30g/l，ph6.0。
所述的继代培养基为：ms4.43g/l+6-ba6mg/l+zt4mg/l+naa0.03mg/l+kt3mg/l+琼脂粉9g/l+蔗糖30g/l，ph6.0。
所述的壮苗培养基为：ms4.43g/l+6-ba3mg/l+tdz3mg/l+naa0.05mg/l+琼脂粉9g/l+蔗糖20g/l，ph6.0。
所述的生根培养基为：ms4.43g/l+naa0.5mg/l+琼脂粉9g/l+蔗糖15g/l，ph6.0。
本发明所述的利用紧穗野生稻根为外植体获得组培苗的方法，具体操作方法如下：
外植体的选择：选择2-3月份往年稻莊刚冒新芽植株连根拔起，装入自封袋中备用。
外植体清洗：将自封袋中的备用植株取出，用自来水冲洗掉根部淤泥，切下植株整株稻根，用无菌水冲洗三遍，放置无菌工作台中，待用。
外植体无菌处理：将待用的稻根放置在三角瓶中，加入0.1%的体积百分比氯化汞处理两次，时间分别是8min和6min，并不断摇动，倒掉，用无菌水洗7遍，再用吸水纸将表面水吸干，待用。
外植体接种：将待用稻根分别切成0.8-1.0cm长，接种在愈伤诱导培养基上。
愈伤诱导培养：将0.8-1.0cm长稻根接种在愈伤诱导培养基上，置于28℃，暗培养箱中培养，培养30天，换培养基一次，再培养10天，稻根出现透明白点，继续培养25-30天，愈伤长至0.5cm，将愈伤接种到愈伤增殖培养基上，愈伤诱导培养基：ms4.43g/l+2,4-d10mg/l+琼脂粉9g/l+蔗糖30g/l，ph5.8。
愈伤增殖培养：将0.5cm的愈伤接入愈伤增殖培养基上，置于28℃，暗培养箱中进行愈伤增殖培养。培养25-30天，换增殖培养基一次，继续培养30天，增殖愈伤长至1.1-1.3cm时，接入分化培养基中进行分化培养。愈伤增殖培养基：ms4.43g/l+2,4-d5mg/l+琼脂粉9g/l+蔗糖30g/l，ph5.8。
分化培养:将1.1-1.3cm增殖愈伤接入到分化培养基中，置于28℃，2000lux光照培养箱中进行光照分化培养。培养30天后，再接入分化继代培养基中进行分化继代培养。分化培养基：ms4.43g/l+6-ba6mg/l+zt4mg/l+naa0.03mg/l+琼脂粉9g/l+蔗糖30g/l，ph6.0。
分化继代培养：将分化培养30天的愈伤接入的分化继代培养基中，培养条件不变。培养18天，愈伤出现淡绿点，继续培养10-25天，分化继代愈伤完成了由绿点凸起，分化出完整独立小苗，到小苗长至1.0-1.7cm时，接入壮苗培养基中进行壮苗培养。分化继代培养基：ms4.43g/l+6-ba6mg/l+zt4mg/l+naa0.03mg/l+kt3mg/l+琼脂粉9g/l+蔗糖30g/l，ph6.0。
壮苗培养：将1.0-1.7cm的小苗接入的壮苗培养基中，置于28℃，3000lux光照培养箱中进行壮苗培养。培养33天，小苗长至2.5-3.2cm的健壮苗有待进行生根培养。壮苗培养基：ms4.43g/l+6-ba3mg/l+tdz3mg/l+naa0.05mg/l+琼脂粉9g/l+蔗糖20g/l，ph6.0。
生根培养：将长至2.5-3.2cm的健壮苗接入生根培养基中，置于28℃，3000lux光照培养箱中进行生根培养。生根培养5-20天，完成了由根基部长出根尖到主根、须根长出，直至根长2-3cm，此时进行炼苗培养。生根培养基：ms4.43g/l+naa0.5mg/l+琼脂粉9g/l+蔗糖15g/l，ph6.0。
炼苗培养：将已生根根长2-3cm组培苗取出，用自来水冲洗掉粘附在根部的培养基，加自来水淹没根基部，用水过渡培养3天，再加入10g腐殖土继续培养10天，待长出新根，即刻移栽大田。
本发明利用紧穗野生稻稻根进行组织培养的方法，采用紧穗野生稻稻根器官作为外植体，最大程度地突破了野生稻常规繁育的范围，解决克服了组培中选择外植体的局限性，扩大了外植体的选择范围，大大增加了繁育数量，节约了时间和成本，真正意义上将组织培养材料应用到生产实践中去。
下面以具体实施案例对本发明做进一步说明：
实施例1
本实施例采用了斯里兰卡紧穗野生稻稻根为实验材料，采用本发明方法获得了再生植株。实施具体步骤如下：
外植体的选择：选择2-3月份往年稻莊刚冒新芽植株连根拔起，装入自封袋中备用。
外植体清洗：将自封袋中的备用植株取出，用自来水冲洗掉根部淤泥，切下植株整株稻根，用无菌水冲洗三遍，放置无菌工作台中，待用。
外植体无菌处理：将待用的稻根放置在三角瓶中，加入0.1%的体积百分比氯化汞处理两次，时间分别是8min和6min，并不断摇动，倒掉，用无菌水洗7遍，再用吸水纸将表面水吸干，待用。
外植体接种：将待用稻根分别切成0.8-1.0cm长，接种在愈伤诱导培养基上。
愈伤诱导培养：将0.8-1.0cm长稻根接种在愈伤诱导培养基上，置于28℃，暗培养箱中培养，培养30天，换培养基一次，再培养10天，稻根出现透明白点，继续培养25-30天，愈伤长至0.5cm，将愈伤接种到愈伤增殖培养基上，愈伤诱导培养基：ms4.43g/l+2,4-d10mg/l+琼脂粉9g/l+蔗糖30g/l，ph5.8。
愈伤增殖培养：将0.5cm的愈伤接入愈伤增殖培养基上，置于28℃，暗培养箱中进行愈伤增殖培养。培养25-30天，换增殖培养基一次，继续培养30天，增殖愈伤长至1.1-1.3cm时，接入分化培养基中进行分化培养。愈伤增殖培养基：ms4.43g/l+2,4-d5mg/l+琼脂粉9g/l+蔗糖30g/l，ph5.8。
分化培养:将1.1-1.3cm增殖愈伤接入到分化培养基中，置于28℃，2000lux光照培养箱中进行光照分化培养。培养30天后，再接入分化继代培养基中进行分化继代培养。分化培养基：ms4.43g/l+6-ba6mg/l+zt4mg/l+naa0.03mg/l+琼脂粉9g/l+蔗糖30g/l，ph6.0。
分化继代培养：将分化培养30天的愈伤接入的分化继代培养基中，培养条件不变。培养18天，愈伤出现淡绿点，继续培养10-25天，分化继代愈伤完成了由绿点凸起，分化出完整独立小苗，到小苗长至1.0-1.7cm时，接入壮苗培养基中进行壮苗培养。分化继代培养基：ms4.43g/l+6-ba6mg/l+zt4mg/l+naa0.03mg/l+kt3mg/l+琼脂粉9g/l+蔗糖30g/l，ph6.0。
壮苗培养：将1.0-1.7cm的小苗接入的壮苗培养基中，置于28℃，3000lux光照培养箱中进行壮苗培养。培养33天，小苗长至2.5-3.2cm的健壮苗有待进行生根培养。壮苗培养基：ms4.43g/l+6-ba3mg/l+tdz3mg/l+naa0.05mg/l+琼脂粉9g/l+蔗糖20g/l，ph6.0。
生根培养：将长至2.5-3.2cm的健壮苗接入生根培养基中，置于28℃，3000lux光照培养箱中进行生根培养。生根培养5-20天，完成了由根基部长出根尖到主根、须根长出，直至根长2-3cm，此时进行炼苗培养。生根培养基：ms4.43g/l+naa0.5mg/l+琼脂粉9g/l+蔗糖15g/l，ph6.0。
炼苗培养：将已生根根长2-3cm组培苗取出，用自来水冲洗掉粘附在根部的培养基，加自来水淹没根基部，用水过渡培养3天，再加入10g腐殖土继续培养10天，待长出新根，即刻移栽大田。
实施例2
同实施例1，不同之处在于实施例2的试验材料为乌干达紧穗野生稻根，愈伤诱导培养稻根出现透明白点为29天。三，分化继代培养25天，愈伤出现淡绿点，继续培养15-33天，分化继代愈伤完成了由绿点凸起，分化出完整独立小苗。
实施例3
同实施例1，不同之处在于诱导培养基为：ms4.0g/l+2,4-d8mg/l+琼脂粉8g/l+蔗糖20g/l，ph5.0；
增殖培养基为：ms5.0g/l+2,4-d12mg/l+琼脂粉10g/l+蔗糖40g/l，ph7.0；
分化培养基为：ms5.0g/l+6-ba6mg/l+zt5mg/l+naa0.04mg/l+琼脂粉10g/l+蔗糖40g/l，ph5.0~7.0；
继代培养基为：ms5.0g/l+6-ba6mg/l+zt5mg/l+naa0.04mg/l+kt4mg/l+琼脂粉10g/l+蔗糖40g/l，ph7.0；
壮苗培养基为：ms5.0g/l+6-ba6mg/l+tdz5mg/l+naa0.06mg/l+琼脂粉10g/l+蔗糖40g/l，ph7.0；
生根培养基为：ms5.0g/l+naa0.04mg/l+琼脂粉10g/l+蔗糖20g/l，ph7.0。
实施例4
同实施例1，不同之处在于诱导培养基为：ms5.0g/l+2,4-d12mg/l+琼脂粉10g/l+蔗糖40g/l，ph7.0；
增殖培养基为：ms4.0g/l+2,4-d8mg/l+琼脂粉8g/l+蔗糖20g/l，ph5.0；
分化培养基为：ms4.0g/l+6-ba6mg/l+zt3mg/l+naa0.02mg/l+琼脂粉8g/l+蔗糖20g/l，ph5.0；
继代培养基为：ms4.0g/l+6-ba6mg/l+zt3mg/l+naa0.02mg/l+kt2mg/l+琼脂粉8g/l+蔗糖20g/l，ph5.0；
壮苗培养基为：ms4.0g/l+6-ba6mg/l+tdz3mg/l+naa0.04mg/l+琼脂粉8g/l+蔗糖20g/l，ph5.0；
生根培养基为：ms4.0g/l+naa0.02mg/l+琼脂粉8g/l+蔗糖10g/l，ph5.0。
实施例5
同实施例1，不同之处在于诱导培养基为：ms4.5g/l+2,4-d10mg/l+琼脂粉9g/l+蔗糖30g/l，ph6.0；
增殖培养基为：ms4.5g/l+2,4-d10mg/l+琼脂粉9g/l+蔗糖30g/l，ph5.8；
分化培养基为：ms4.0~5.0g/l+6-ba6mg/l+zt3~5mg/l+naa0.03mg/l+琼脂粉9g/l+蔗糖30g/l，ph5.8；
继代培养基为：ms4.5g/l+6-ba6mg/l+zt4mg/l+naa0.03mg/l+kt3mg/l+琼脂粉9g/l+蔗糖30g/l，ph5.5；
壮苗培养基为：ms4.5g/l+6-ba6mg/l+tdz4mg/l+naa0.05mg/l+琼脂粉9g/l+蔗糖30g/l，ph5.8；
生根培养基为：ms4.5g/l+naa0.03mg/l+琼脂粉9g/l+蔗糖15g/l，ph6.0。
实际应用表明：本发明不仅突破了应用野生稻植株稻根作外植体诱导愈伤获得再生苗的难题，并且紧穗野生稻稻根的愈伤诱导率和成苗率达到100%，是一种大量获得紧穗野生稻后代的高效方法，并值得广泛推广。