本发明涉及植物组织培养领域，具体涉及一种组培用油菜种子的灭菌方法。
背景技术：
油菜属十字花科芸苔属植物，是一种重要的油料作物，其产品既可以加工成人类食用油、工业润滑油，也可以作为绿肥和堆肥。据报道，在2014-2015年间，全球的菜籽油产量超过269.8万吨，为第三大产油植物。通过转基因技术快速获得理想性状油菜栽培种，现在已被广泛使用，据国际农业生物技术应用服务组织（isaaa）统计，2016年转基因作物种植面积达1.851亿公顷，且全球种植的油菜有24%为转基因品种（http://www.isaaa.org），获得转基因油菜的普遍做法是农杆菌介导转化法，通过组织培养获得转基因油菜，而组织培养技术的第一步就是油菜种子的无菌化处理，种子灭菌是转基因油菜成功的关键。
目前使用最多的油菜种子灭菌剂为次氯酸钠（naclo），值得注意的是如果使用的naclo浓度过低或灭菌时间不够，种子灭菌就不彻底，播种后容易滋生病原菌，苗容易被病原菌感染；浓度过高或灭菌时间过久，则会损伤种子，令种子发芽不正常甚至无法发芽，无法获得足够的苗用于转基因研究，而目前报道的naclo使用浓度从0.1%到50%，灭菌时间从6min到45min不等，这为转基因油菜研究的应用推广带来了极大的困难。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明旨在提供一种组培用油菜种子的灭菌方法，用不同浓度的naclo灭菌油菜种子不同时间来筛选出最适合的种子灭菌浓度和灭菌时间，提高油菜种子灭菌效率。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种组培用油菜种子的灭菌方法，包括如下步骤：
（1）先将组培用油菜种子放在水中浸泡1h，去除浮在水面上的种子；
（2）用自来水冲洗2遍；
（3）用75%酒精处理消毒1min；
（4）用0%-30%naclo灭菌10-30min；
（5）用无菌水冲洗5-6次，最后用无菌滤纸吸去种子上的水份；
（6）将种子播种到ms种子萌发培养基上；
（7）播种5日后，统计种子发芽率、健康芽率和菌落数。
优选的，步骤（4）中，naclo浓度为3%，灭菌种子时间为15min。
步骤（6）中，ms种子萌发培养基为：ms培养基2.22g/l+蔗糖30g/l+琼脂粉8g/l，ph值为5.8。
步骤（6）中，培养环境为：25℃、相对湿度60%-70%，前2日全暗处理，后3日2000lx光照16h/日。
本发明的优点在于：
本发明处理方法通过比较目前报道的naclo灭菌浓度和时间，得到了用naclo灭菌油菜种子的最佳浓度和时间，在节约了naclo的使用成本的同时，又节省了种子灭菌的操作时间，在不影响种子发芽率的基础上，又可以获得最多的健康芽率，获得足够的健康苗用于油菜的转基因研究。本发明为油菜的遗传转化研究奠定了坚实的基础，可以提高油菜转基因用的外植体数量，从而提高遗传转化的效率。
具体实施方式
以下通过具体实施范例对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例10%-30%naclo灭菌种子大范围筛选
挑选饱满且无明显伤痕的种子放在水中浸泡1h，去除浮在水面上的种子后，自来水冲洗几遍，之后转移至超净工作台内操作，75%酒精消毒1分钟，无菌水冲洗2遍，再用不同浓度naclo（0%，0.1%，1%，5%，10%，20%，30%；另设一不用75%酒精，仅用无菌h2o的对照处理组）灭菌10min，之后用无菌水漂洗6遍，转移至无菌干燥的滤纸上晾干，播种于ms种子萌发培养基，每组处理32颗种子，共4个重复。
上述种子播种于ms种子萌发培养基为：ms培养基2.22g/l+蔗糖30g/l+琼脂粉8g/l，ph值为5.8。培养环境：25℃、相对湿度60%-70%，前2日全暗处理，后3日2000勒克斯(lx)光照16h/日。播种5日后，统计种子发芽率，健康芽率（茎秆高于5cm，子叶正常展开且未生菌的苗为健康芽），菌落数。
表1：0%-30%naclo灭菌种子大范围筛选结果
种子发芽率=（发芽的种子数/播种种子数）×100%
种子健康芽率=（健康芽数/播种种子数）×100%
发芽率和健康芽率数据进行平方根的反正炫（arcsin
实验结果发现，不同浓度naclo灭菌后的种子发芽率具有显著性差异（df1,2=7,24,f=222.644,p<0.001），发芽率最高的处理组1%naclo，种子发芽率为99.2%，健康芽率为94.5%，产生的菌落数较少。
实施例21%-5%naclo灭菌种子小范围筛选
从实施例1可知，1%浓度naclo对种子灭菌效果最佳，但是值得注意的是，1%与5%naclo灭菌种子得到的发芽率与健康芽率差异显著，因此有理由怀疑在1%-5%浓度间存在一个更加适合种子灭菌的浓度，为了验证这一假设，我们做了实施例2，具体如下：
挑选饱满且无明显伤痕的种子放在水中浸泡1h，去除浮在水面上的种子后，自来水冲洗几遍，之后转移至超净工作台内操作，75%酒精消毒1分钟，无菌水冲洗2遍，再用不同浓度naclo（1%，2%，3%，4%，5%）灭菌10min，之后用无菌水漂洗6遍，转移至无菌干燥的滤纸上晾干，播种于ms种子萌发培养基，每组处理32颗种子，共4个重复。
上述种子播种于ms种子萌发培养基为：ms培养基2.22g/l+蔗糖30g/l+琼脂粉8g/l，ph值为5.8。培养环境：25℃、相对湿度60%-70%，前2日全暗处理，后3日2000勒克斯(lx)光照16h/日。播种5日后，统计种子发芽率，健康芽率（茎秆高于5cm，子叶正常展开且未生菌的苗为健康芽），菌落数。
表2：1%-5%naclo灭菌种子小范围筛选结果
种子发芽率=（发芽的种子数/播种种子数）×100%
种子健康芽率=（健康芽数/播种种子数）×100%
发芽率和健康芽率数据进行平方根的反正炫（arcsin
实验结果表明1%-5%naclo对种子灭菌后的发芽率没有显著性差异（df1,2=4,15,f=2.190,p=0.12），但健康芽率存在着显著性差异（df1,2=4,15,f=21.877,p<0.001），2%、3%和1%naclo灭菌种子得到的健康芽率最高，不同浓度处理组间产生的菌落数也存在着显著性差异（df1,2=4,16,f=7.045,p=0.002），1%naclo处理组产生的菌落数最多，显著高于其它处理组。因此，我们可知2%或3%naclo灭菌种子的效果最好，但考虑到高浓度灭菌效果会更好，最后认为最佳的浓度为3%。
实施例3最佳浓度naclo灭菌时间筛选
挑选饱满且无明显伤痕的种子放在水中浸泡1h，去除浮在水面上的种子后，自来水冲洗几遍，之后转移至超净工作台内操作，75%酒精消毒1分钟，无菌水冲洗2遍，再用3%naclo灭菌种子10min、15min、20min、25min和30min，之后用无菌水漂洗6遍，转移至无菌干燥的滤纸上晾干，播种于ms种子萌发培养基，每组65颗种子，3个重复。
上述种子播种于ms种子萌发培养基为：ms2.22g/l+蔗糖30g/l+琼脂粉8g/l，ph值为5.8。培养环境：25℃、相对湿度60%-70%，前2日全暗处理，后3日2000勒克斯(lx)光照16h/日。播种5日后，统计种子发芽率，健康芽率（茎秆高于5cm，子叶正常展开且未生菌的苗为健康芽），菌落数。
表3：最佳浓度naclo灭菌时间筛选
种子发芽率=（发芽的种子数/播种种子数）×100%
种子健康芽率=（健康芽数/播种种子数）×100%
发芽率和健康芽率数据进行平方根的反正炫（arcsin
实验结果表明，3%naclo灭菌种子10-30min对种子的发芽率（df1,2=4,10,f=2.018,p=0.168）和产生的菌落数（df1,2=4,10,f=1.238,p=0.355）均无显著差异，但健康芽率存在显著性的差异（df1,2=4,15,f=3.875,p=0.037），灭菌15min、20min、30min和25min得到的健康芽率显著高于10min处理组，其中灭菌15min得到的健康芽率最高，为81.5%，因此，3%naclo灭菌种子最佳时间为15min。
但是，上述具体实施方式只是示例性的，是为了更好的使本领域技术人员能够理解本专利，不能理解为是对本专利包括范围的限制；只要是根据本专利所揭示精神的所作的任何等同变更或修饰，均落入本专利包括的范围。