本发明涉及一种黄瓜褐斑病抗性育种方法，属于果蔬育种领域。
背景技术：
黄瓜（学名：cucumissativusl.）也称胡瓜、青瓜，起源于喜马拉雅山南麓的热带雨林地区，为葫芦科黄瓜属1年蔓生草本植物，在我国已有2000多年的栽培历史。黄瓜果实颜色呈油绿或翠绿，表面有柔软的小刺，口感爽脆，食用方式多样，是深受人们喜爱的蔬果。黄瓜富含糖类、维生素b2、维生素c、维生素e、胡萝卜素、尼克酸、钙、磷、铁等营养成分，具有降血糖、抗氧化、防衰老、美容护肤、减肥强体等功效，同时还可作为一种中药材，主治热病、烦渴、咽喉肿痛、火眼和烫伤。
黄瓜性喜温暖，不耐寒冷，适合生长在温带和热带地区，因此过去我国黄瓜露地栽培地区分布很不均匀，主要集中在一些气候条件及自然环境比较好的省份，如山东、河南、广东、海南等地。近年来，随着农业产业结构调整及设施园艺的发展，我国保护地黄瓜生产迅速发展起来，目前已占到了黄瓜种植面积的42%左右，其中塑料大棚面积约为23%，节能日光温室面积约为17%，玻璃日光温室约为2%，利用设施栽培不受季节和地域的限制，可实现黄瓜周年生产与供应。然而由于保护地内高温高湿，且空间相对密闭，如防治不当极易滋生病害并迅速扩散。
黄瓜褐斑病（又称靶斑病）是黄瓜的一种叶部病害，其病原菌为半知菌亚门的瓜棒孢霉菌[corynesporacassiicola（berk.＆curt.）wei.]。该病原菌在5~40℃均可生长，在适宜的条件下可快速繁殖，并且产生大量分生孢子，借气流或施肥、灌溉传播蔓延。黄瓜褐斑病多在黄瓜盛瓜期开始发病，具体症状表现为中、下部叶片先发病，再向上部叶片发展，严重时蔓延至叶柄、茎蔓。叶片发病时，初期在叶面生出灰褐色小斑点，后逐渐扩展成大小不等的圆形或近圆形边缘不太整齐的淡褐色或褐色病斑，病斑大小为3-30mm，以10-15mm中型斑较多；中期病斑扩大为圆形或不规则形，易穿孔；后期多个相邻病斑常连成片，病、健交界明显，呈深黄褐色，叶片很快枯黄而死。发病重时，茎蔓和叶柄上也会出现椭圆形的灰褐色病斑，病斑扩展较大时能引起整株枯死。
近年来，黄瓜褐斑病在黄瓜生产上的危害有加重趋势。该病在露地和保护地均可发生，尤以保护地内发生严重。露地主要危害叶片，一般发病时落叶率可达5-10%，严重时落叶率可达60%，严重影响植株光合作用，从而造成减产；保护地由于高温高湿的环境特点，更有利于病原菌繁殖，而叶面结露、光照不足、昼夜温差小都会加重病害发生程度，如果防控不当，该病会迅速发展并蔓延，仅需1周左右该病导致的落叶率就可由5%发展至90%，造成整个植株死亡，黄瓜产量损失极大。
为了防治黄瓜褐斑病，生产上大多采用农业防治与化学防治结合的方法。农业防治通常是指采取一些积极的栽培措施，如种子消毒、合理轮作、合理施肥灌溉以及加强保护地栽培管理等；化学防治是指在发病初期喷施化学药剂进行治疗。但是这些方法防治效果有时不甚理想，而且喷施化学药剂所带来的化学品残留和环境污染问题更不容小觑。因此，为了发展高产、高效和绿色环保农业，促进我国黄瓜产业的可持续发展，必须高度重视培育和推广抗病品种，将褐斑病抗性改良作为一项重要的育种目标。
黄瓜常规的抗病育种方法是利用引种、选择育种、杂交育种等常规育种途径选育出一批垂直抗性和水平抗性较好的优良品种和品系，但是缺点是育种周期长，需要长期大量的人工大田筛选，费时费力，效率低下，已越来越不能满足黄瓜抗病育种的需求。单倍体育种是现代生物技术育种手段之一，即利用植物组织培养技术诱导产生单倍体，再通过某种手段使染色体组加倍，从而使植物恢复正常染色体数，因此单倍体育种培育出的个体都为纯合体，在今后种植过程中个体自交后代都不会出现性状分离情况。在育种实践中，利用单倍体育种技术不仅可以快速获得纯系，缩短育种周期，而且可以得到更多更广泛的变异，特别是隐性性状更容易得到表现，从而丰富育种基础材料的类型，加速育种进程，与常规的育种方法相比，具有显著的优势。而花药培养是人工诱导获得单倍体和纯合多倍体的有效途径之一，也是本发明研究的重点。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种能提高黄瓜褐斑病抗性筛选效率、缩短抗病育种周期，从而加快黄瓜抗病育种进程的黄瓜褐斑病抗性育种方法。
为了实现以上目的，本发明的技术方案如下：
一种黄瓜褐斑病抗性育种方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
1）育种材料的选取
选择农艺和产量性状优良但褐斑病抗性不足的当地黄瓜主栽品种作为待改良黄瓜品种，选择黄瓜种质资源库中经褐斑病抗性鉴定表现为高抗的黄瓜品种作为黄瓜褐斑病抗源品种；正季种植待改良黄瓜品种和黄瓜褐斑病抗源品种；
2）将待改良黄瓜品种与黄瓜褐斑病抗源品种杂交
以步骤1）正季种植的待改良黄瓜品种为母本，黄瓜褐斑病抗源品种为父本进行杂交，获得f1代杂交种；
3）对选取的待改良黄瓜品种和黄瓜褐斑病抗源品种分别进行花药诱导培养
在黄瓜初花期，采集小孢子发育时期为单核靠边期的待改良黄瓜品种和黄瓜褐斑病抗源品种的花蕾，将花蕾用湿润的纱布包裹后置于4℃低温预处理48h，然后对花蕾进行消毒，在无菌条件下剥取花药接种于诱导培养基上，在特定的培养条件下分别诱导出愈伤组织；
4）粗毒素浓缩液的提取
将瓜棒孢霉菌菌种转接到pda培养基上，置于25℃恒温培养箱中扩繁7天；接种5个直径约4mm的菌饼到250mlps培养液中，28℃摇床振荡培养14天获得菌液；把获得的菌液进行过滤，得到的滤液在60℃下进行旋转蒸发直至滤液到达原体积的1/10，以4500r/min在离心机中进行离心去沉淀，将获得的上清液加入等体积的乙醚进行萃取，重复3次，合并3次的乙醚萃取相，在旋转蒸发仪上45℃进行旋转蒸发去除乙醚，获得的浆状物加水定容至1ml即为粗毒素浓缩液，置于4℃冰箱保存；
5）粗毒素筛选压的鉴定
将粗毒素浓缩液进行稀释，配成不同浓度的粗毒素稀释液，并添加到制备好的花药分化培养基中，使分化培养基含有梯度浓度的粗毒素，然后将步骤s2中获得的待改良黄瓜品种和黄瓜褐斑病抗源品种的愈伤组织分别转接到上述分化培养基上，在温度23-27℃、光照强度1500-2000lx、每天光照12-14h的条件下进行培养，筛选出二者愈伤组织分化率均在2.0%左右的分化培养基对应添加的粗毒素浓度，将两个粗毒素浓度的平均值作为黄瓜花药分化培养粗毒素筛选压；
6）f1代杂交种花药培养，粗毒素筛选后获得再生植株
正季种植f1代杂交种，待植株进入初花期时，选取长势良好的植株进行花药诱导培养，操作方法与步骤2）相同，将获得的愈伤组织转接到添加了褐斑病粗毒素筛压的分化培养基上进行培养，分化培养基配方与培养条件与步骤4）相同，获得不定芽；当分化出的不定芽长成2-4cm高的芽苗后转接到生根培养基上，在温度26-28℃、光照强度2400-2800lx、每天光照14-16h的条件下培养26-34d，获得花培再生植株；
7）炼苗移栽
当花培再生植株根系长至4-6条，根长3-5cm时，将其移至温室中利用自然光照进行炼苗，不打开瓶盖炼苗3d，打开瓶盖炼苗5d；然后将花培苗从瓶内移出，洗净附着在根部的培养基后移栽入基质中，在适宜的条件进行常规栽培管理；
8）褐斑病抗性鉴定与后代筛选
将成熟的黄瓜花培苗进行单株收种获得不同花培家系，进一步栽培后，对其抗病性进行接种鉴定，筛选出褐斑病高抗且农艺和产量性状与育种主干亲本相近的单株，再经1-2代系谱选择即获得黄瓜褐斑病抗性新品系。
所述步骤3）中小孢子发育时期的鉴别方法为：首先根据花蕾形态大小鉴别，选出长度为0.6~1.8cm的闭合花蕾，进一步将花蕾中的花药挑取2~4枚碾碎，释放出花粉，用醋酸洋红染色后镜检确认小孢子发育时期为单核靠边期。
所述步骤3）中花蕾消毒的方法为：将花蕾用自来水冲洗30min，然后转移到超净工作台上，先在75%乙醇中浸泡消毒60s，用无菌水冲洗1-2次，再转入0.1%hgcl2中浸泡消毒10min，用无菌水冲洗3-5次；冲洗干净后用无菌滤纸吸干花蕾表面水分。
所述步骤3）中愈伤组织诱导培养基的配方为：n6+半胱氨酸盐酸盐25mg/l+生物素0.8mg/l+谷胱甘肽0.5g/l+聚乙烯醇0.8mg/l+甜菜碱20mg/l+n-甲基-n-亚硝基脲1.1mg/l+2,4-d1.0mg/l+四甲基戊二酸0.2mg/l+聚乙烯吡咯烷酮0.3g/l+土豆泥33mg/l+茶多酚10mg/l，ph值为5.6~6.0。
所述步骤2）中特定的培养条件是指温度23-27℃，避光培养。
所述步骤5）中分化培养基的配方为：kno32200mg/l，nh4no3564mg/l，mgso4·7h2o280mg/l，nah2po4150mg/l，cacl2·2h2o255mg/l，mnso4·4h2o22.3mg/l，znso4·7h2o5.5mg/l，h3bo36.4mg/l，na2moo4·2h2o0.25mg/l，cocl2·6h2o0.025mg/l，cuso4·5h2o0.25mg/l，fe-na2edta33.6mg/l，k2cr2o70.019mg/l，肌醇85mg/l，烟酸1.4mg/l，甘氨酸2.0mg/l，色氨酸3.4mg/l，牛肉浸膏27mg/l，盐酸硫胺素0.3mg/l，盐酸吡哆醇0.5mg/l，泛酸1.2mg/l，姜黄素4.9mg/l，l-硒-甲基硒代半胱氨酸0.11mg/l，左旋肉碱5.5mg/l，迷迭香提取液33ml/l，腐殖酸40mg/l，6-ba2.0mg/l，康多酚0.5mg/l，芸苔素内酯0.2mg/l，苯肽胺酸0.2mg/l，ph值为5.6~6.0。
所述步骤6）中生根培养基的配方为：1/2ms+iba0.2mg/l+氯化胆碱0.05mg/l，ph值为5.6~6.0。
所述步骤7）中适宜的条件是指白天温度控制在20-30℃，夜间温度控制在15-20℃，光照强度控制在2500-5000lx，湿度控制在60-80%。
所述迷迭香提取液的制备方法为：将迷迭香植株放入蒸馏水中先煮沸0.5h，然后保持水温60-70℃提取2.5h，将汁液过滤除去固体残渣，再用无菌过滤器在超净工作台中过滤制成无菌提取液备用。
本发明与现有技术相比具有以下优点：
1、本发明利用黄瓜花药愈伤组织在分化过程中对褐斑病病菌粗毒素敏感的特点，首先采用含有梯度浓度病原菌粗毒素的分化培养基对黄瓜亲本愈伤组织进行粗毒素筛选，确定适宜的粗毒素筛选压，再以此为标准对f1代杂交种进行筛选，从而提高了抗病材料的筛选效率。
2、本发明优化了黄瓜花药培养体系，并特别摸索出一种适用于在添加病原菌粗毒素条件下的黄瓜花药分化培养程序，为抗病材料的筛选提供了保证。
3、本发明的育种方法结合了单倍体育种技术，杂种f1代通过花药培养获得了纯合的花培家系，再经过进一步的褐斑病抗性鉴定与后代筛选，2-3年即可获得黄瓜褐斑病抗性新品系，与常规育种方法相比，极大的加快了黄瓜褐斑病抗病育种的进程，对黄瓜抗病育种的发展具有很高的推动价值。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。
实施例1
2014至2016年，按照本发明的技术方案进行黄瓜褐斑病抗性育种，该方案的技术路线如下：
1）育种材料的选取
选择山东省主要的保护地栽培黄瓜品种‘鲁圣顶峰1号’作为待改良黄瓜品种，‘鲁圣顶峰1号’植株生长势较强，分枝性弱，以主蔓结瓜为主，瓜条长棒状，皮深绿色，刺白色，刺密，肉质清脆，香味浓，品质好，早熟，较耐寒，较耐弱光，喜肥水充足，但对褐斑病抗性不高；选择黄瓜品种‘津优3号’作为黄瓜褐斑病抗源品种，该品种由天津科润黄瓜研究所育成，褐斑病抗性鉴定中表现为高抗；正季种植‘鲁圣顶峰1号’和‘津优3号’。
2）将待改良黄瓜品种与黄瓜褐斑病抗源品种杂交
以步骤1）正季种植的‘鲁圣顶峰1号’为母本，‘津优3号’为父本进行杂交，获得f1代杂交种。
3）对选取的待改良黄瓜品种和黄瓜褐斑病抗源品种分别进行花药诱导培养
在黄瓜初花期，采集小孢子发育时期为单核靠边期的‘鲁圣顶峰1号’和‘津优3号’的花蕾（其中小孢子发育时期的鉴别方法为：首先根据花蕾形态大小鉴别，选出长度为0.6~1.8cm的闭合花蕾，进一步将花蕾中的花药挑取2~4枚碾碎，释放出花粉，用醋酸洋红染色后镜检确认小孢子发育时期为单核靠边期），将花蕾用湿润的纱布包裹后置于4℃低温预处理48h，然后将花蕾用自来水冲洗30min，然后转移到超净工作台上，先在75%乙醇中浸泡消毒60s，用无菌水冲洗1-2次，再转入0.1%hgcl2中浸泡消毒10min，用无菌水冲洗3-5次；冲洗干净后用无菌滤纸吸干花蕾表面水分，在无菌条件下剥取花药接种于诱导培养基上，在温度23-27℃、避光条件下分别诱导出愈伤组织；
其中诱导培养基的配方为：n6+半胱氨酸盐酸盐25mg/l+生物素0.8mg/l+谷胱甘肽0.5g/l+聚乙烯醇0.8mg/l+甜菜碱20mg/l+n-甲基-n-亚硝基脲1.1mg/l+2，4-d1.0mg/l+四甲基戊二酸0.2mg/l+聚乙烯吡咯烷酮0.3g/l+土豆泥33mg/l+茶多酚10mg/l，ph值为5.8。
4）粗毒素浓缩液的提取
将瓜棒孢霉菌菌种转接到pda培养基上，置于25℃恒温培养箱中扩繁7天；接种5个直径约4mm的菌饼到250mlps培养液中，28℃摇床振荡培养14天获得菌液；把获得的菌液进行过滤，得到的滤液在60℃下进行旋转蒸发直至滤液到达原体积的1/10，以4500r/min在离心机中进行离心去沉淀，将获得的上清液加入等体积的乙醚进行萃取，重复3次，合并3次的乙醚萃取相，在旋转蒸发仪上45℃进行旋转蒸发去除乙醚，获得的浆状物加水定容至1ml即为粗毒素浓缩液，置于4℃冰箱保存。
5）粗毒素筛选压的鉴定
将粗毒素浓缩液进行稀释，配成浓度为0、2.5%、5.0%、7.5%、10.0%、12.5%的粗毒素稀释液，并添加到制备好的花药分化培养基中（分化培养基的配方为：kno32200mg/l，nh4no3564mg/l，mgso4·7h2o280mg/l，nah2po4150mg/l，cacl2·2h2o255mg/l，mnso4·4h2o22.3mg/l，znso4·7h2o5.5mg/l，h3bo36.4mg/l，na2moo4·2h2o0.25mg/l，cocl2·6h2o0.025mg/l，cuso4·5h2o0.25mg/l，fe-na2edta33.6mg/l，k2cr2o70.019mg/l，肌醇85mg/l，烟酸1.4mg/l，甘氨酸2.0mg/l，色氨酸3.4mg/l，牛肉浸膏27mg/l，盐酸硫胺素0.3mg/l，盐酸吡哆醇0.5mg/l，泛酸1.2mg/l，姜黄素4.9mg/l，l-硒-甲基硒代半胱氨酸0.11mg/l，左旋肉碱5.5mg/l，迷迭香提取液33ml/l，腐殖酸40mg/l，6-ba2.0mg/l，康多酚0.5mg/l，芸苔素内酯0.2mg/l，苯肽胺酸0.2mg/l，ph值为5.8；其中迷迭香提取液的制备方法为：将迷迭香植株放入蒸馏水中先煮沸0.5h，然后保持水温60-70℃提取2.5h，将汁液过滤除去固体残渣，再用无菌过滤器在超净工作台中过滤制成无菌提取液备用），使分化培养基含有梯度浓度的粗毒素，然后将步骤s2中获得的‘鲁圣顶峰1号’和‘津优3号’的愈伤组织分别转接到上述分化培养基上，在温度23-27℃、光照强度1500-2000lx、每天光照12-14h的条件下进行培养，筛选出二者愈伤组织分化率均在2.0%左右的分化培养基对应添加的粗毒素浓度，将两个粗毒素浓度的平均值作为黄瓜花药分化培养粗毒素筛选压，结果见下表1；
由以上结果可知，‘鲁圣顶峰1号’的花药分化率在2.0%左右时，其分化培养基添加的粗毒素浓度约为5.5%，‘津优3号’的花药分化率在2.0%左右时，其分化培养基添加的粗毒素浓度约为10.0%，取二者的平均值7.75%作为褐斑病粗毒素筛选压，在后续试验中使用。
6）f1代杂交种花药培养，粗毒素筛选后获得再生植株
正季种植f1代杂交种，待植株进入初花期时，选取长势良好的植株进行花药诱导培养，操作方法与步骤2）相同，将获得的愈伤组织转接到添加了褐斑病粗毒素筛压的分化培养基上进行培养，分化培养基配方与培养条件与步骤4）相同，获得不定芽；当分化出的不定芽长成2-4cm高的芽苗后转接到生根培养基上（生根培养基配方为1/2ms+iba0.2mg/l+氯化胆碱0.05mg/l，ph值为5.8），在温度26-28℃、光照强度2400-2800lx、每天光照14-16h的条件下培养26-34d，获得花培再生植株。
7）炼苗移栽
当花培再生植株根系长至4-6条，根长3-5cm时，将其移至温室中利用自然光照进行炼苗，不打开瓶盖炼苗3d，打开瓶盖炼苗5d；然后将花培苗从瓶内移出，洗净附着在根部的培养基后移栽入基质中，白天温度控制在20-30℃，夜间温度控制在15-20℃，光照强度控制在2500-5000lx，湿度控制在60-80%，进行常规栽培管理。
8）褐斑病抗性鉴定与后代筛选
将成熟的黄瓜花培苗进行单株收种获得146个不同花培家系，进一步栽培后，对其抗病性进行接种鉴定，筛选出褐斑病高抗且农艺和产量性状与育种主干亲本相近的单株，再经1-2代系谱选择最终获得3个黄瓜褐斑病抗性新品系。
对比例1
为了分析本发明的分化培养基在添加粗毒素的情况下，对黄瓜花药分化效果的影响：只替换步骤5）中的分化培养基，并添加相同浓度梯度的粗毒素提取液，分化培养基引用文献《黄瓜（cucumissativusl.）花药培养》中的配方ms+0.1mg/lnaa+3.0mg/l6-ba+3%蔗糖+0.8%琼脂，将结果统计如下表2。
比较表1与表2中的结果，在粗毒素浓度为0的情况下，‘鲁圣顶峰1号’和‘津优3号’的花药分化率没有显著差异，而添加了粗毒素后，对比例1中‘鲁圣顶峰1号’和‘津优3号’的花药分化率极低甚至部分化，无法进行后续试验；显著的结果差异说明本发明的分化培养基更适合于在有粗毒素的条件，进行的黄瓜花药分化培养，原因可能是本发明的分化培养基中添加了色氨酸、姜黄素、l-硒-甲基硒代半胱氨酸、左旋肉碱、芸苔素内酯、康多酚、迷迭香提取液等物质，能够增强细胞活性，提高植物组织抗逆性，从而使褐斑病抗性强的愈伤组织能够正常分化。
可以理解的是，以上关于本发明的具体描述，仅用于说明本发明而并非受限于本发明实施例所描述的技术方案，本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换，以达到相同的技术效果；只要满足使用需要，都在本发明的保护范围之内。