本发明属于石斛培养领域，具体涉及一种铁皮石斛原球茎的增殖分化培养基及其应用。
背景技术：
：铁皮石斛(deudrobiumofficiuale)是兰科石斛属多年生附生草本植物，为我国特有的名贵药材，李时珍在《本草纲目》中评价铁皮石斛“强阴益精，厚肠胃，补内绝不足，平胃气，长肌肉，益智除惊，轻身延年”；民间称其为“救命仙草”。多分布于海拔近千米的山地半阴湿岩石上，加上长期采挖，使得野生铁皮石斛资源日渐枯竭。因其种子无胚乳，需结合共生菌才能正常萌发，故实生苗的栽培难度大。传统的无性繁殖方式繁殖系数低，原球茎的培养经过诱导、分化、增殖三个阶段，原球茎的培养的好坏直接影响铁皮石斛的茎段粗细多少、生根率以及成苗率。原球茎的培养需要进行常用的固定培养基，在取茎时会造成茎部损害，且幼苗对营养液的汲取后产生的分布不均；液体培养基，会造成缺氧；此外，常见的圆球茎增殖分化后成苗移栽后普通出现抗逆性差，阳光适应能力差即阳光强易造成灼伤，阳光少易滋生真菌。技术实现要素：发明目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供了一种铁皮石斛原球茎培养基。技术方案：为解决上述技术问题，本发明提供一种铁皮石斛原球茎培养基，其特征在于：包括诱导培养基，增殖和分化培养基；所述诱导培养基由以下组分组成：ms基本培养基，6-苄氨基腺嘌呤1.6～2.5mg/l，萘乙酸0.6～0.8mg/l，pqq0.5～1.5umol/l，植物提取混合物16～28mg/l，蔗糖80～120mg/l，培养基功能液5～8mg/l；所述增殖和分化培养基由以下组分组成：1/2ms基本培养基，6-苄氨基腺嘌呤1.6～2.5mg/l，萘乙酸0.6～0.8mg/l，pqq0.5～1.5umol/l，植物提取混合物16～28mg/l，蔗糖40～60mg/l，维生素b20.2~0.3mg/l；培养基功能液5～8mg/l；所述ms基本培养基由以下组分组成：硝酸铵nh4no3600mg/l硝酸钙ca(no3)2·4h2o656mg/l氯化钙cacl2·2h2o196mg/l硫酸镁mgso4·7h2o370mg/l磷酸二氢钾kh2po4170mg/l硫酸钾k2so4990mg/l乙二胺四乙酸二钠na2·edta37.3mg/l硫酸亚铁feso4·7h2o27.8mg/l硫酸锰mnso4·h2o22.3mg/l硫酸锌znso4·7h2o8.6mg/l硼酸h3bo38.2mg/l钼酸钠na2moo4·2h2o0.25mg/l硫酸铜cuso4·5h2o0.05mg/l氯化钴cocl2.6h2o20.05mg/l肌醇c6h12o6·2h2o500mg/l甘氨酸nh2·ch2·cooh5mg/l盐酸硫胺素c12h17clos·2hcl2mg/l盐酸吡哆醇c8h10no5p0.8mg/l烟酸nc5h4cooh0.8mg/l；所述1/2ms基本培养基由以下组分组成：硝酸铵nh4no3300mg/l硝酸钙ca(no3)2·4h2o328mg/l氯化钙cacl2·2h2o98mg/l硫酸镁mgso4·7h2o185mg/l磷酸二氢钾kh2po485mg/l硫酸钾k2so4495mg/l乙二胺四乙酸二钠na2·edta37.3mg/l硫酸亚铁feso4·7h2o27.8mg/l硫酸锰mnso4·h2o22.3mg/l硫酸锌znso4·7h2o8.6mg/l硼酸h3bo38.2mg/l钼酸钠na2moo4·2h2o0.25mg/l硫酸铜cuso4·5h2o0.05mg/l氯化钴cocl2.6h2o20.05mg/l肌醇c6h12o6·2h2o500mg/l甘氨酸nh2·ch2·cooh5mg/l盐酸硫胺素c12h17clos·2hcl2mg/l盐酸吡哆醇c8h10no5p0.8mg/l烟酸nc5h4cooh0.8mg/l进一步地，所述植物提取液由桑叶提取物、黄芩提取物以及鞣质组成；桑叶提取物桑树枝条上的第1～3位新叶加工的桑叶粉为原料，阴干，粉碎，分别用正丁醇、90%乙醇和水加温浸提，并喷雾干燥而得；黄芩提取物黄芩经提取干燥制得的淡黄色的粉末。进一步地，所述桑叶提取物、黄芩提取物以及鞣质三者之间的重量份比依次分别为5：4：1。进一步地，所述培养基功能液由芦荟凝胶、皂甙以及棕榈酸组成。进一步地，所述芦荟凝胶、皂甙以及棕榈酸的重量份比例依次分别为6:4:1。进一步地，所述培养基应用步骤如下：1）从铁皮石斛植株上切下长2～5cm的幼嫩茎段，在流水下冲洗，用刷子蘸少许洗衣粉水溶液轻轻刷洗，并经自来水充分洗净。在超净工作台上将茎段放置在75%的酒精中消毒30s后，再用0.1%的hgcl2水溶液浸泡8～10min，无菌水冲洗5～6次；2）诱导培养：用解剖刀将铁皮石斛的幼嫩茎段切下，接种在诱导培养基中进行培养；15～20天后，外植体开始萌动，茎段膨大，切面及顶部组织形成疏松组织；继续培养20天后，转入微放置室中，切面及顶部膨大组织的表面形成凹凸不平的颗粒物，随着培养时间的延长，颗粒物长大形成直径1～2mm的类原球茎颗粒物；3）增殖分化培养：将诱导形成的原球茎转入到增殖分化培养基中，原球茎增殖速度很快，增殖倍数可达8～10倍，同时部分原球茎开始分化出芽点并长出1～2片小叶，进行一定条件光照；原球茎的增殖与芽分化同时进行。进一步地，所述光照条件为，光质为红光或红、蓝混合光。进一步地，所述光照条件为：光强为90-100μmol·m-2·s-1，光照时间9小时/天。有益效果：本发明相对于现有技术而言具备以下优点：1）本发明提供的培养基中培养基功能液包括芦荟凝胶、皂甙以及棕榈酸且通过特定比例，使得培养基呈液体与固定之间，培养基呈悬浮状态，液体之间呈微流动状态，使得培养基中的组分之间均匀，不会因石斛茎芽发育而造成的组分分布不均；且最后成苗移栽时，比较容易拔出，不易伤茎根。2）本发明提供的培养基中植物提取混合物包括桑叶提取物、黄芩提取物以及鞣质以及特定比例，能够适应增殖分化期间的光照强度，从而成苗率高，成苗移栽后，阳光适应能力强，完成适应南京地区三伏天的光照强度，不会造成灼伤等现象。3）本发明改进的1/2ms基本培养基和ms基本培养基，与培养基其他组分相互配合作用，能够大大增高增殖系数，增殖倍数可达8～10倍，培养周期短。具体实施方式本实施例中用的基本培养基的配置一致，具体如下：ms基本培养基和1/2ms基本培养基中：包括如下成份：常量元素的组分如下：硝酸铵（nh4no3）、硝酸钙（ca(no3)2·4h2o）、氯化钙（cacl2·2h2o）、硫酸镁（mgso4·7h2o）、磷酸二氢钾（kh2po4）、硫酸钾（k2so4）；微量元素的组分和其对应的使用浓度如下：硫酸锰（mnso4·h2o）、硫酸锌（znso4·7h2o）、硼酸（h3bo3）、钼酸钠（na2moo4·2h2o）、硫酸铜（cuso4·5h2o）、氯化钴（cocl2.62）；铁盐的组分如下：乙二胺四乙酸二钠（na2·edta）、硫酸亚铁（feso4·7h2o）；有机成分的组分如下：肌醇、甘氨酸（gly）、盐酸硫胺素（vb1）、盐酸吡哆醇（vb6）、烟酸（vpp）。ms基本培养基由以下组分组成：硝酸铵nh4no3600mg/l硝酸钙ca(no3)2·4h2o656mg/l氯化钙cacl2·2h2o196mg/l硫酸镁mgso4·7h2o370mg/l磷酸二氢钾kh2po4170mg/l硫酸钾k2so4990mg/l乙二胺四乙酸二钠na2·edta37.3mg/l硫酸亚铁feso4·7h2o27.8mg/l硫酸锰mnso4·h2o22.3mg/l硫酸锌znso4·7h2o8.6mg/l硼酸h3bo38.2mg/l钼酸钠na2moo4·2h2o0.25mg/l硫酸铜cuso4·5h2o0.05mg/l氯化钴cocl2.6h2o20.05mg/l肌醇c6h12o6·2h2o500mg/l甘氨酸nh2·ch2·cooh5mg/l盐酸硫胺素c12h17clos·2hcl2mg/l盐酸吡哆醇c8h10no5p0.8mg/l烟酸nc5h4cooh0.8mg/l；1/2ms基本培养基由以下组分组成：硝酸铵nh4no3300mg/l硝酸钙ca(no3)2·4h2o328mg/l氯化钙cacl2·2h2o98mg/l硫酸镁mgso4·7h2o185mg/l磷酸二氢钾kh2po485mg/l硫酸钾k2so4495mg/l乙二胺四乙酸二钠na2·edta37.3mg/l硫酸亚铁feso4·7h2o27.8mg/l硫酸锰mnso4·h2o22.3mg/l硫酸锌znso4·7h2o8.6mg/l硼酸h3bo38.2mg/l钼酸钠na2moo4·2h2o0.25mg/l硫酸铜cuso4·5h2o0.05mg/l氯化钴cocl2.6h2o20.05mg/l肌醇c6h12o6·2h2o500mg/l甘氨酸nh2·ch2·cooh5mg/l盐酸硫胺素c12h17clos·2hcl2mg/l盐酸吡哆醇c8h10no5p0.8mg/l烟酸nc5h4cooh0.8mg/l实施例1：一种铁皮石斛原球茎培养基，包括诱导培养基，增殖和分化培养基；所述诱导培养基由以下组分组成：ms基本培养基，6-苄氨基腺嘌呤1.6mg/l，萘乙酸0.8mg/l，pqq1.5umol/l，植物提取混合物28mg/l，蔗糖120mg/l，培养基功能液8mg/l；所述增殖和分化培养基由以下组分组成：1/2ms基本培养基，6-苄氨基腺嘌呤2.5mg/l，萘乙酸0.6mg/l，pqq0.5umol/l，植物提取混合物16mg/l，蔗糖40mg/l，维生素b20.2mg/l；培养基功能液5mg/l；其中，植物提取液由桑叶提取物、黄芩提取物以及鞣质组成；桑叶提取物桑树枝条上的第1～3位新叶加工的桑叶粉为原料，阴干，粉碎，分别用正丁醇、90%乙醇和水加温浸提，并喷雾干燥而得；黄芩提取物黄芩经提取干燥制得的淡黄色的粉末。所述桑叶提取物、黄芩提取物以及鞣质三者之间的重量份比依次分别为5：4：1。所述培养基功能液由芦荟凝胶、皂甙以及棕榈酸组成。所述芦荟凝胶、皂甙以及棕榈酸的重量份比例依次分别为6:4:1。上述培养基应用步骤如下：1）从铁皮石斛植株上切下长2～5cm的幼嫩茎段，在流水下冲洗，用刷子蘸少许洗衣粉水溶液轻轻刷洗，并经自来水充分洗净。在超净工作台上将茎段放置在75%的酒精中消毒30s后，再用0.1%的hgcl2水溶液浸泡8～10min，无菌水冲洗5～6次；2）诱导培养：用解剖刀将铁皮石斛的幼嫩茎段切下，接种在诱导培养基中进行培养；15～20天后，外植体开始萌动，茎段膨大，切面及顶部组织形成疏松组织；继续培养20天后，转入微放置室中，切面及顶部膨大组织的表面形成凹凸不平的颗粒物，随着培养时间的延长，颗粒物长大形成直径1～2mm的类原球茎颗粒物；3）增殖分化培养：将诱导形成的原球茎转入到增殖分化培养基中，原球茎增殖速度很快，同时部分原球茎开始分化出芽点并长出1～2片小叶，进行一定条件光照；原球茎的增殖与芽分化同时进行。所述光照条件为，光质为红、蓝混合光。所述光照条件为：光强为90μmol·m-2·s-1，光照时间9小时/天。实施例2：一种铁皮石斛原球茎培养基，其特征在于：包括诱导培养基，增殖和分化培养基；所述诱导培养基由以下组分组成：ms基本培养基，6-苄氨基腺嘌呤2.5mg/l，萘乙酸0.6mg/l，pqq0.5umol/l，植物提取混合物16mg/l，蔗糖80mg/l，培养基功能液5mg/l；所述增殖和分化培养基由以下组分组成：1/2ms基本培养基，6-苄氨基腺嘌呤1.6mg/l，萘乙酸0.8mg/l，pqq1.5umol/l，植物提取混合物28mg/l，蔗糖60mg/l，维生素b20.3mg/l；培养基功能液8mg/l；其中，植物提取液由桑叶提取物、黄芩提取物以及鞣质组成；桑叶提取物桑树枝条上的第1～3位新叶加工的桑叶粉为原料，阴干，粉碎，分别用正丁醇、90%乙醇和水加温浸提，并喷雾干燥而得；黄芩提取物黄芩经提取干燥制得的淡黄色的粉末。所述桑叶提取物、黄芩提取物以及鞣质三者之间的重量份比依次分别为5：4：1。所述培养基功能液由芦荟凝胶、皂甙以及棕榈酸组成。所述芦荟凝胶、皂甙以及棕榈酸的重量份比例依次分别为6:4:1。上述培养基应用步骤如下：1）从铁皮石斛植株上切下长2～5cm的幼嫩茎段，在流水下冲洗，用刷子蘸少许洗衣粉水溶液轻轻刷洗，并经自来水充分洗净。在超净工作台上将茎段放置在75%的酒精中消毒30s后，再用0.1%的hgcl2水溶液浸泡8～10min，无菌水冲洗5～6次；2）诱导培养：用解剖刀将铁皮石斛的幼嫩茎段切下，接种在诱导培养基中进行培养；15～20天后，外植体开始萌动，茎段膨大，切面及顶部组织形成疏松组织；继续培养20天后，转入微放置室中，切面及顶部膨大组织的表面形成凹凸不平的颗粒物，随着培养时间的延长，颗粒物长大形成直径1～2mm的类原球茎颗粒物；3）增殖分化培养：将诱导形成的原球茎转入到增殖分化培养基中，原球茎增殖速度很快，同时部分原球茎开始分化出芽点并长出1～2片小叶，进行一定条件光照；原球茎的增殖与芽分化同时进行。所述光照条件为，光质为红光或红、蓝混合光，所述光照条件为：光强为95μmol·m-2·s-1，光照时间9小时/天。实施例3：一种铁皮石斛原球茎培养基，包括诱导培养基，增殖和分化培养基；所述诱导培养基由以下组分组成：ms基本培养基，，萘乙酸0.7mg/l，pqq0.8umol/l，植物提取混合物23mg/l，蔗糖110mg/l，培养基功能液6mg/l；所述增殖和分化培养基由以下组分组成：1/2ms基本培养基，6-苄氨基腺嘌呤1.8mg/l，萘乙酸0.7mg/l，pqq0.7umol/l，植物提取混合物22mg/l，蔗糖50mg/l，维生素b20.25mg/l；培养基功能液6mg/l；其中，植物提取液由桑叶提取物、黄芩提取物以及鞣质组成；桑叶提取物桑树枝条上的第1～3位新叶加工的桑叶粉为原料，阴干，粉碎，分别用正丁醇、90%乙醇和水加温浸提，并喷雾干燥而得；黄芩提取物黄芩经提取干燥制得的淡黄色的粉末。所述桑叶提取物、黄芩提取物以及鞣质三者之间的重量份比依次分别为5：4：1。所述培养基功能液由芦荟凝胶、皂甙以及棕榈酸组成。所述芦荟凝胶、皂甙以及棕榈酸的重量份比例依次分别为6:4:1。上述培养基应用步骤如下：1）从铁皮石斛植株上切下长2～5cm的幼嫩茎段，在流水下冲洗，用刷子蘸少许洗衣粉水溶液轻轻刷洗，并经自来水充分洗净。在超净工作台上将茎段放置在75%的酒精中消毒30s后，再用0.1%的hgcl2水溶液浸泡8～10min，无菌水冲洗5～6次；2）诱导培养：用解剖刀将铁皮石斛的幼嫩茎段切下，接种在诱导培养基中进行培养；15～20天后，外植体开始萌动，茎段膨大，切面及顶部组织形成疏松组织；继续培养20天后，转入微放置室中，切面及顶部膨大组织的表面形成凹凸不平的颗粒物，随着培养时间的延长，颗粒物长大形成直径1～2mm的类原球茎颗粒物；3）增殖分化培养：将诱导形成的原球茎转入到增殖分化培养基中，原球茎增殖速度很快，同时部分原球茎开始分化出芽点并长出1～2片小叶，进行一定条件光照；原球茎的增殖与芽分化同时进行。所述光照条件为，光质为红光或红、蓝混合光。所述光照条件为：光强为100μmol·m-2·s-1，光照时间9小时/天。实施例4：一种铁皮石斛原球茎培养基，包括诱导培养基，增殖和分化培养基；所述诱导培养基由以下组分组成：ms基本培养基，6-苄氨基腺嘌呤2.3mg/l，萘乙酸0.7mg/l，pqq1.3umol/l，植物提取混合物26mg/l，蔗糖115mg/l，培养基功液6mg/l；所述增殖和分化培养基由以下组分组成：1/2ms基本培养基，6-苄氨基腺嘌呤1.9mg/l，萘乙酸0.7mg/l，pqq0.7umol/l，植物提取混合物26mg/l，蔗糖55mg/l，维生素b20.26mg/l；培养基功能液6mg/l；其中，植物提取液由桑叶提取物、黄芩提取物以及鞣质组成；桑叶提取物桑树枝条上的第1～3位新叶加工的桑叶粉为原料，阴干，粉碎，分别用正丁醇、90%乙醇和水加温浸提，并喷雾干燥而得；黄芩提取物黄芩经提取干燥制得的淡黄色的粉末。所述桑叶提取物、黄芩提取物以及鞣质三者之间的重量份比依次分别为5：4：1。所述培养基功能液由芦荟凝胶、皂甙以及棕榈酸组成。所述芦荟凝胶、皂甙以及棕榈酸的重量份比例依次分别为6:4:1。上述培养基应用步骤如下：1）从铁皮石斛植株上切下长2～5cm的幼嫩茎段，在流水下冲洗，用刷子蘸少许洗衣粉水溶液轻轻刷洗，并经自来水充分洗净。在超净工作台上将茎段放置在75%的酒精中消毒30s后，再用0.1%的hgcl2水溶液浸泡8～10min，无菌水冲洗5～6次；2）诱导培养：用解剖刀将铁皮石斛的幼嫩茎段切下，接种在诱导培养基中进行培养；15～20天后，外植体开始萌动，茎段膨大，切面及顶部组织形成疏松组织；继续培养20天后，转入微放置室中，切面及顶部膨大组织的表面形成凹凸不平的颗粒物，随着培养时间的延长，颗粒物长大形成直径1～2mm的类原球茎颗粒物；3）增殖分化培养：将诱导形成的原球茎转入到增殖分化培养基中，原球茎增殖速度很快，同时部分原球茎开始分化出芽点并长出1～2片小叶，进行一定条件光照；原球茎的增殖与芽分化同时进行。所述光照条件为，光质为红光或红、蓝混合光。所述光照条件为：光强为100μmol·m-2·s-1，光照时间9小时/天。对比例：1、诱导培养基：ms+2.0mg/l6-苄氨基腺嘌呤+3%蔗糖+0.8%琼脂；2、增殖化分培养基：ms+20%马铃薯+3%蔗糖+0.8%琼脂；其他培养条件相同。本实施例1~3经过近万株石斛培养试验，采集数据如下：实施例灼伤率平均增殖系数实施例10.03%8实施例20.02%8实施例30.01%9实施例40.01%9对比例15%4以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12