一种蛹虫草多孢分离装置及方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种蛹虫草多孢分离装置及方法。

背景技术：

蛹虫草[cordycepsmilitaris(l.etfr)link]属于子囊菌门、核菌纲、球壳目、麦角菌科、虫草属，是寄生于夜蛾科等昆虫蛹上的，不同于冬虫夏草的一种虫草，又叫北冬虫夏草、蛹草、北虫草等。目前生产中菌种分离技术主要有组织分离、孢子分离以及基内菌丝分离法等。组织分离是一种无性繁殖技术，是指切取食用菌子实体或菌核等的任何一部分组织接种到培养基上培养成纯菌丝体的方法。组织分离法会因为子实体的截取位置选取，生长周期选取、批次的选取产生不同结果，有时也会因个人的操作经验、操作手法等影响实验结果。孢子分离是利用食用菌成熟的有性孢子萌发形成菌丝体来获得纯菌种的方法。由孢子分离得到的菌种、性状优良、菌龄较短、生命力旺盛。孢子分离分为多孢分离和单孢分离两种。大部分多孢分离所获得的菌丝体基本上能够形成子实体，对于不易进行组织分离，孢子容易萌发的菌类，采用多孢分离较易成功。在进行多孢分离的过程中，现有技术中惯用的手段是：在蛹虫草释放孢子的时期，将蛹虫草从培养基中摘离，并进行孢子的收集。该方法存在的问题是：1、在摘除的过程中容易破坏孢子，影响其萌发；2、对于蛹虫草释放孢子时期需要经验的判断，不易掌握；3、摘除后的蛹虫草失去了养分在一定时间内即会失水干枯。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术中，对蛹虫草多孢分离的不足，提供一种蛹虫草多孢分离装置及方法，本装置及方法可以减少在操作时对子囊孢子的伤害，还可避免错过对孢子收集的最佳生长期，从而得到生命力旺盛的孢子。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种蛹虫草多孢分离装置，包括互相匹配的筒盖与筒体以及限位铁丝、底门等结构，所述筒体内部设置有用于承接培育有蛹虫草的培养皿的限位铁丝，限位铁丝通过设置于筒体壁上的小孔予以固定，在筒体的底部设置有可沿水平方向开启或关闭方便收集孢子的培养皿进出的底门。

在上述技术方案中，所述限位铁丝的数量为3根，三者连接形成三角形状。

在上述技术方案中，所述限位铁丝距离筒体开口处3-4cm。

一种蛹虫草多孢分离方法，按照下列步骤进行：

步骤一、选取生长成熟、无污染的蛹虫草，不进行摘取，连带培养基从组培盒中取出倒置于分离装置的筒体内，利用限位铁丝将培养基固定使蛹虫草自然垂直朝下；

步骤二、将不含养分的孢子收集培养皿通过底门放置进筒体内，使之位于蛹虫草的垂直下方；

步骤三、将分离装置放置于无菌环境下，使蛹虫草在不中断生长的情况下释放子囊孢子，待成熟子实体将子囊孢子弹射在步骤二中所述孢子收集培养皿后，取出孢子收集培养皿，对子囊孢子进行切取收集。

在上述技术方案中，步骤二中，所述孢子收集培养皿由摩尔体积比为0.8％的琼脂以及蒸馏水配制而成。

在上述技术方案中，步骤三中，蛹虫草的培养时间为5-10天。

在上述技术方案中，步骤三中，在收集好子囊孢子后，切取收集含有子囊孢子的水琼脂表面，并接在pda培养基上，在温度为19-23℃无菌环境下培养，萌发出菌丝后，刮取菌丝放入保藏溶液中，密封后在-4℃～-70℃低温下保藏。

在上述技术方案中，所述pda培养基的配方为：土豆200g，葡萄糖20g，琼脂15～20g，水1000ml。

在上述技术方案中，所述保藏溶液由30％甘油溶液中加入0.4克琼脂配制而成。

本发明的优点和有益效果为：本方法选取生长成熟、无污染的蛹虫草，不进行摘取，连带培养基从组培盒中取出倒置于分离装置的筒体内，使蛹虫草在不中断生长的情况下释放子囊孢子，待成熟子实体将子囊孢子弹射在孢子收集培养皿后，再对子囊孢子进行切取收集，该方法可以减少在操作时对子囊孢子的伤害，还可避免错过对孢子收集的最佳生长期，从而得到生命力旺盛的孢子，用于后续的培养及镜检操作。

附图说明

图1是本发明中分离装置结构示意图。

其中，1为筒盖，2为筒体，3为限位铁丝，4为底门，5为培养基。

对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，可以根据以上附图获得其他的相关附图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。

本发明蛹虫草的多孢分离及保藏采用如下方法进行：

(1)孢子收集装置的制备

孢子分离的装置采用总瓶高为14.5cm，瓶口直径为9.5cm，瓶底直径为8.3cm，带有透气盖的耐高温塑料组培盒。顶部和底部均可以拧盖打开，组培盒顶部的瓶盖是透气盖，组培盒的底部是6.5cm高，直径为8.3cm不带盖的小组培盒，与瓶身底部可拼接，用来盛放配置好的培养基。在距瓶口3-5cm的瓶身位置，环绕选取3个点，使其可以构成等边三角形，根据限位铁丝的粗细将3个点打孔，将铁丝插入孔中，构建成一个三角形的铁丝框，作为是收集孢子的装置结构。

(2)水琼脂培养基的制备

蒸馏水中加入0.8％琼脂，分装到组培盒后，在121℃高温高压灭菌锅内灭菌30min。

(3)多孢分离亲本子实体的选取

选取整盒正常生长，生长良好健壮，无感染的成熟子实体，在子实体头部将要出现乳头状突起时放入收集装置中，这标志着内部的子囊壳伸长外露，即将释放孢子。选取好后，将培养瓶表面消毒后带入超净工作台。

(4)孢子的收集

在无菌操作的条件下，将选取的子实体连带培养基取出，和收集装置瓶口对比一下，把多余出来的部分截取掉，保证不影响放入收集装置内的三角框上。缓慢放置的过程中，用镊子拨开会被铁丝压住的子实体，保证其平稳的放在三角框上，盖上透气盖。在20-23℃光照条件下放置5-10天，让成熟孢子弹射在水琼脂培养基上。

(5)pda平板培养基和菌丝体保藏溶液制备

pda培养基：马铃薯洗净去皮，切成小块称取200g，加水煮20min(直至马铃薯能被玻璃棒戳破即可)，用纱布过滤取汁，加20g琼脂，加热搅拌，待琼脂溶解完后，加入葡萄糖20g，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1000毫升，分装无菌培养皿，121℃高温高压灭菌锅中灭菌30分钟，冷却后放入无菌环境备用。

菌丝体保藏溶液：根据所需用量配置浓度为30％的甘油溶液，在甘油溶液中加入0.4％琼脂，分装在拧盖的50ml离心管中，121℃高温高压灭菌30min，冷却室温后，选取流动性较好的使用。

(6)收集孢子菌丝体的培养与保藏

在超净工作台内用接菌铲铲取收集有子囊孢子的水琼脂培养基表面，接入制备好的pda平板培养基上，在20-23℃条件下培养5-7d，待其布满菌丝。用无菌铲在无菌环境下刮取菌丝，放入菌丝体保藏液中，封口，震荡一会儿用牛皮纸塑料袋包好，放在冰箱-4℃保藏。

(7)保藏菌种活化

在超净工作台内打开一管保藏菌，用消过毒的移液枪移取100μl菌液转接到100mlpd液体培养基中，摇床上摇培，培养好的菌丝球可直接进行出草实验。

实例1蛹虫草菌种制备与保藏

(1)孢子收集装置的制备

将上述方法中所描述耐高温塑料组培盒，环绕选取3个点，使其可以构成等边三角形，根据市场购买细铁丝的粗细将3个点打孔，将铁丝插入孔中，构建成一个三角形的铁丝框，这便是收集孢子的装置结构。

(2)水琼脂培养基的制备

蒸馏水中加入0.8％琼脂，分装在收集装置30ml，在121℃高温高压灭菌锅内灭菌30min。

(3)多孢分离亲本子实体的选取

选取整盒正常生长，生长良好健壮，无感染的成熟子实体，在子实体头部将要出现乳头状突起时放入收集装置中，这标志着内部的子囊壳伸长外露，即将释放孢子。选取好后，将培养瓶表面消毒后带入超净工作台。

(4)孢子的收集

在无菌操作的条件下，将选取的子实体连带培养基取出，和收集装置瓶口对比一下，把多余出来的部分截取掉，保证不影响放入收集装置内的三角框上。放置过程要缓慢，同时还要用镊子拨开会被铁丝压住的子实体，最后保证平稳的放在三角框上，盖上透气盖。在20-23℃光照条件下放置7-10天，让成熟孢子弹射在水琼脂培养基上。

(5)收集孢子菌丝体的培养及保藏

按上述方法中的描述，制备好培养菌丝体所用的pda培养基与菌丝体保藏溶液。在超净工作台内用接菌铲铲取收集有子囊孢子的水琼脂培养基表面，接入制备好的pda平板培养基上，在20-23℃条件下培养7d，待其布满菌丝。用无菌铲在无菌环境下刮取菌丝，放入菌丝体保藏液中，封口，震荡一会儿用牛皮纸塑料袋包好，放在冰箱-4℃保藏。

实例2

实验时间：2017年9月

1、菌种：

蛹虫草(购自广东江门鸿豪生物科技公司)

2、摇培所用培养基：

去皮马铃薯250g(煮汁)，葡萄糖25g，硫酸镁1.5g，磷酸二氢钾1.2g，磷酸氢二钾1.8g，vb115mg，vb610mg，ph值为6.5左右，定容至1000ml，分装在250ml三角瓶中，每瓶100ml。

3、蛹虫草生产营养液：

黄豆50g(榨汁)，全脂奶粉25g，5％硫酸镁50ml，11％磷酸二氢钾50ml，2％vb150ml，2％vb650ml，定容至5000ml。

4、所用耐高温塑料带透气盖组培盒：

组培盒：口径10cm，底直径8cm，高8.5cm，容量为480ml。每盒装30g大米并加入营养液40ml，混合后灭菌，冷却至室温后接菌。

5、菌丝生长阶段的管理：

接菌后的大米培养基在避光环境培养7天，温度范围控制在19-23℃，湿度范围控制在60％-70％。在此期间，培养室要按时消毒，如有感染及时清理。

6、子实体生长阶段的管理：

避光培养7天后菌丝布满整个培养基表面并吃透培养基底部，开始见光培养，避免太阳光直射，在培养室自然光下培养，如果光线较暗可开日光灯补充光照，最合适的光照强度在550-1000lx范围。菌丝见光后，培养基会转色呈橘黄色，表面会形成米粒状突起的菌蕾，进一步分化形成子实体。子实体生长阶段，温度范围控制在20-23℃，高于25℃子实体生长缓慢甚至过早成熟，湿度范围控制在60％-85％，子实体培养过程中保持使室内空气流通，培养室定时消毒。

7、菌种收集与保藏：

根据实例1所描述方法，分离与收集蛹虫草菌种并保藏。

实例3

实验时间：2018年1月

1、菌种：

实例2所制的保藏菌种

2、摇培所用培养基：

去皮马铃薯250g(煮汁)，葡萄糖25g，硫酸镁1.5g，磷酸二氢钾1.2g，磷酸氢二钾1.8g，vb115mg，vb610mg，ph值为6.5左右，定容至1000ml，分装在250ml三角瓶中，每瓶100ml。

3、蛹虫草生产营养液：

黄豆50g(榨汁)，全脂奶粉25g，5％硫酸镁50ml，11％磷酸二氢钾50ml，2％vb150ml，2％vb650ml，定容至5000ml。

4、所用耐高温塑料带透气盖组培盒：

组培盒：口径10cm，底直径8cm，高8.5cm，容量为480ml。每盒装30g大米并加入营养液40ml，混合后灭菌，冷却至室温后接菌。

5、菌丝生长阶段的管理：

接菌后的大米培养基在避光环境培养7天，温度范围控制在19-23℃，湿度范围控制在60％-70％。在此期间，培养室要按时消毒，如有感染及时清理。

6、子实体生长阶段的管理：

避光培养7天后菌丝布满整个培养基表面并吃透培养基底部，开始见光培养，避免太阳光直射，在培养室自然光下培养，如果光线较暗可开日光灯补充光照，最合适的光照强度在550-1000lx范围。菌丝见光后，培养基会转色呈橘黄色，表面会形成米粒状突起的菌蕾，进一步分化形成子实体。子实体生长阶段，温度范围控制在20-23℃，高于25℃子实体生长缓慢甚至过早成熟，湿度范围控制在60％-85％，子实体培养过程中要使室内空气流通，如有感染及时清理，培养室定时消毒。

7、采收：

采收后平均鲜重达到20.3克/瓶

实例4

实验时间：2018年3月底

1、菌种：

实例2所得的保藏菌种

2、摇培所用培养基：

去皮马铃薯250g(煮汁)，葡萄糖25g，硫酸镁1.5g，磷酸二氢钾1.2g，磷酸氢二钾1.8g，vb115mg，vb610mg，ph值为6.5左右，定容至1000ml，分装在250ml三角瓶中，每瓶100ml。

3、蛹虫草生产营养液：

黄豆50g(榨汁)，全脂奶粉25g，5％硫酸镁50ml，11％磷酸二氢钾50ml，2％vb150ml，2％vb650ml，定容至5000ml。

4、所用耐高温塑料带透气盖组培盒：

组培盒：口径10cm，底直径8cm，高8.5cm，容量为480ml。每盒装30g大米并加入营养液40ml，混合后灭菌，冷却至室温后接菌。

5、菌丝生长阶段的管理：

接菌后的大米培养基在避光环境培养7天，温度范围控制在19-23℃，湿度范围控制在60％-70％。在此期间，培养室要按时消毒，如有感染及时清理。

6、子实体生长阶段的管理：

避光培养7天后菌丝布满整个培养基表面并吃透培养基底部，开始见光培养，避免太阳光直射，在培养室自然光下培养，如果光线较暗可开日光灯补充光照，最合适的光照强度在550-1000lx范围。菌丝见光后，培养基会转色呈橘黄色，表面会形成米粒状突起的菌蕾，进一步分化形成子实体。子实体生长阶段，温度范围控制在20-23℃，高于25℃子实体生长缓慢甚至过早成熟，湿度范围控制在60％-85％，子实体培养过程中要使室内空气流通，如有感染及时清理，培养室定时消毒。

7、采收：

采收后平均鲜重达到21.28g

结论：

通过实例2、3和4结果的比较，蛹虫草子实体生长阶段生长特性、性状以及产量与亲本子实体之间均无显著性差异，从而说明该发明收集菌种的方法可以保留蛹虫草亲本的遗传特性，并且可以作为蛹虫草生产菌种使用，该发明使用的菌种保藏方法也可以有效保藏菌种，不影响菌种质量，可以正常出草。

以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。