一种离体培养提高甜叶菊甜菊双糖苷SBIO含量的方法与流程

本发明属于细胞生物学和生物领域，为一种离体培养提高甜叶菊甜菊双糖苷sbio含量的方法，具体涉及通过甜叶菊离体培养来提高甜叶菊叶片中甜菊双糖苷sbio含量的方法。

背景技术

甜菊糖苷(steviolglycoside，sgs)是一类从甜叶菊(steviarebaudianabertoni)叶子中提取得到的高甜度、低热值甜味剂，甜叶菊被誉为继甘蔗和甜菜之后的“第三糖源”。甜菊糖苷还具有药理活性，如降三高、抗肿瘤、抑菌、增溶、抗腹泻等特性，亦可作为合成其他功能性化合物的前体物质。甜菊糖苷的化学本质为四环二萜。甜菊糖国家标准(gb8270－2014)中列出含量最高的九种甜味成分，即甜菊苷(stevioside，stv)，瑞鲍迪苷a-e(rebaudiosidea、b、c、d和e)，杜克苷a(dulcosidea)，甜茶苷(rubusoside)和甜菊双糖苷(steviolbioside，sbio)。甜菊双糖苷分子式为c32h50o13，分子量为642.73。

甜菊双糖苷与甜菊苷(st)相比，其分子式中的19碳位上少一个葡糖基。甜菊双糖苷具有降血糖，抗结核等功效，也可以作为中间体进一步衍生成为其他生理活性更好的化合物，如甜菊双糖苷酯、甜菊双糖苷酰肼等对抗菌和抗结核具有疗效的化合物。但是，甜菊双糖苷在甜叶菊中的含量很低，而甜菊苷相对含量较高。已有研究报道，甜菊双糖苷可以通过甜菊苷的水解酶法，即β-半乳糖苷酶水解法获得。

已有研究表明，β-半乳糖苷酶可以选择性水解甜菊苷中碳19位糖酯键，从而获得甜菊双糖苷，而且在37.5℃，甜菊苷的底物浓度为25mg/ml，加入β-半乳糖苷酶量为12000u/gst，12h时甜菊苷的转化率为99％以上。但这个方法，只能解决甜菊双糖苷提取的工艺问题，并不能长期解决甜叶菊中提高甜菊双糖苷含量的瓶颈问题。因此，我们考虑到采取离体培养基中加入水解酶的方法，或许能够间接地获得高甜菊双糖苷含量的甜叶菊植株。另外，考虑到甜叶菊从叶片脱分化形成大量愈伤组织的过程中细胞内的甜菊苷，通过吸收培养基中的水解酶，β-半乳糖苷酶，将愈伤组织细胞中的甜菊苷水解为甜菊双糖苷，并在细胞内储存，或重新分配在细胞组织中。但迄今为止，通过离体组织培养提高甜叶菊叶片甜菊双糖苷含量的研究未见报道。因此，我们尝试通过组织培养的方法，向各阶段培养基中添加外源β-半乳糖苷酶，希望获得叶片中甜菊双糖苷含量较高的甜叶菊株系。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种离体培养提高甜叶菊甜菊双糖苷sbio的方法，属于细胞学和生物学领域，其能够快速获得甜菊双糖苷sbio含量高的甜叶菊组培苗，以解决现有技术中存在的问题。

本发明提供一种离体培养提高甜叶菊甜菊双糖苷sbio含量的方法，其主要过程如下：

(1)以甜叶菊叶片为外植体接种到愈伤组织培养基；其培养基组成为：ms+20g/l蔗糖+6g/l琼脂+0.5mg/l6-ba+0.3mg/lnaa+600u/gβ-半乳糖苷酶；其组培室环境温度15-35℃(优选为25±1℃)，光强1500-3000lux(优选为2000lux)，光周期昼7-17h/夜7-17h(优选为光周期昼12h/夜12h)。

(2)经15-30d(优选为20d)产生绿色愈伤组织后，转入芽诱导培养基，其培养基组成为：ms+20g/l蔗糖+6g/l琼脂+0.3mg/l6-ba+0.1mg/lnaa+600u/gβ-半乳糖苷酶中；培养条件为15-35℃(优选为25±1℃)，光强1500-3000lux(优选为2000lux)，光周期昼7-17h/夜7-17h(优选为光周期昼光12h/夜12h)。

(3)再经15-40d(优选为30d)产生幼芽后，转入生根培养基,在生根培养基中培养15-40d(优选为30d)诱导产生大量根系后，按常规继代培养和扩繁，其生根培养基组成为1/2ms+15g/l蔗糖+3g/l琼脂+0.8mg/liba+600u/gβ-半乳糖苷酶；培养条件为温度15-35℃(优选为25±1℃)，光强1500-3000lux(优选为2000lux)，光周期昼7-17h/夜7-17h(优选为光周期昼光12h/夜12h)。

采集甜叶菊组培苗叶片，利用高效液相色谱仪检测甜菊双糖苷含量。结果经处理后，甜菊双糖苷含量由0.27％增加到0.69％左右，增加了1.55倍左右，甜菊双糖苷含量提高效果显著。

本发明具有的优点在于：

本发明提供的离体培养提高甜叶菊甜菊双糖苷sbio含量的方法，从甜菊双糖苷sbio生物合成途径角度出发，推测甜菊双糖苷sbio在离体组织细胞中合成后，在培养基中水解酶的影响下，进行水解转换成甜菊双糖苷sbio，从而在细胞中积累较多的甜菊双糖苷sbio。以此为原理来增加甜叶菊叶子中的甜菊双糖苷sbio含量。因此，本发明尝试通过组织培养的方法，向各阶段培养基中添加外源半乳糖苷酶，以希望获得叶片中甜菊双糖苷含量较高的甜叶菊株系。利用本发明提供的离体培养提高甜叶菊甜菊双糖苷sbio含量的方法,经过培养后甜叶菊甜菊双糖苷sbio含量增加显著，培养过程中各培养基也容易获得，培养过程简单易实施。

附图说明

图1为本发明提供的离体培养提高甜叶菊甜菊双糖苷sbio含量的方法的流程图。

图2为甜叶菊叶片接种到愈伤组织培养基中产生愈伤组织形貌图；

图3为甜叶菊分化芽形貌图；

图4为甜叶菊生根苗形貌图。

具体实施方式

为了更好的阐述本发明专利申请，现结合附图以及具体实施例对本发明所实现的手段加以说明：

本实施例利用国内优良甜叶菊品种，通过高效液相色谱仪检测后，选取了甜菊双糖苷sbio含量较高的甜叶菊品种，采取叶片作为外植体，离体培养提高甜叶菊甜菊双糖苷sbio含量的方法具体如图1所示，包括以下步骤：

(1)外植体消毒：叶片先用蒸馏水冲洗干净，然后在超净工作台上用70％的酒精消毒约10s，再用无菌水冲洗2-3次，再用1％的次氯酸钠溶液浸泡10min，再用无菌水冲洗4-5次；

(2)愈伤组织诱导培养：将外植体接种到愈伤组织诱导培养基上，愈伤组织诱导培养基的成分为ms+20g/l蔗糖+6g/l琼脂+0.3mg/l6-ba+0.6mg/lnaa+600u/gβ-半乳糖苷酶，组培室环境温度25±1℃，光强2000lux，光照12h/d；

(3)芽诱导培养：经20d产生绿色愈伤组织后(形貌如图2所示)，转入加ra的芽诱导培养基中。芽诱导培养基：ms+20g/l蔗糖+6g/l琼脂+0.3mg/l6-ba+0.1mg/lnaa+600u/gβ-半乳糖苷酶；

(4)生根培养：再经30d产生幼芽后(形貌如图3所示)，转入生根培养基中。生根培养基：1/2ms+15g/l蔗糖+3g/l琼脂+0.8mg/liba+600u/gβ-半乳糖苷酶。诱导产生大量根系后(形貌如图4所示)，进行常规继代培养和扩繁。

将叶片晒干后，利用高效液相色谱仪检测甜叶菊叶片中甜菊双糖苷含量，从中筛选出高甜菊双糖苷含量的甜叶菊组培苗。

如下表1和表2所示，采用本发明方法前后的甜菊双糖苷sbio含量数据检测结果可以看出，经过本发明的离体培养方法培养，甜叶菊叶片中甜菊双糖苷sbio含量增加非常明显。

表1：利用本发明培养方法培养的甜叶菊叶片甜菊双糖苷甜菊双糖苷sbio含量的检测数据

表2：现有的甜叶菊叶片甜菊双糖苷甜菊双糖苷sbio含量的检测数据

以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。