本发明涉及的是番茄灰叶斑病接种技术研究领域，具体涉及一种番茄灰叶斑病人工接种技术及抗病材料筛选方法。
背景技术
番茄灰叶斑病是目前一旦发病就很难控制的毁灭性病害，药剂防治不仅易产生抗药性，效果甚微，对环境污染也较重，因此培育抗病品种是解决病害发生和流行的有效途径。抗病材料的筛选和抗病品种的选育首先要有一套方便有效的接种技术，目前国内外对番茄灰叶斑病接种方法采用最多的是喷雾接种法和离体叶片涂抹法，对于大量种质资源的筛选一般采用喷雾接种法，效率高，易操作，离体叶片涂抹法适合定量接种，分析不同品系的抗性，效率较低。苗龄也是非常重要的影响因素，非常幼小的植株相对的有抗性，6～8叶期易感性最高，随着植株生长易感性下降。接种浓度和保湿时间不同，接种效果差异较大，在最易感病的苗龄，接种浓度过大或保湿时间过长，植株发病过重，保湿时间短或接种浓度小，植株发病不明显，因此，选择合适的接种浓度和保湿时间也是抗感材料筛选的关键因素。
由于国内对番茄灰叶斑病接种技术研究较少，本发明提供一种番茄灰叶斑病人工接种技术及抗病材料筛选方法。
技术实现要素：
针对现有技术上存在的不足，本发明目的是在于提供一种番茄灰叶斑病人工接种技术及抗病材料筛选方法，此方法对接种技术进行系统的研究，为后续的抗病品种的选育和种质资源的筛选提供方便快捷方法，为深入研究番茄灰叶斑病抗病遗传育种工作奠定基础。
为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：一种番茄灰叶斑病人工接种技术及抗病材料筛选方法，包括番茄灰叶斑病接种技术研究和番茄主栽品种及育种试材的抗病性鉴定，具体方法步骤如下：
1、选用抗病材料“89”和感病材料“163”为试材，选取苗龄为7～8叶期的幼苗作为接种对象，接种浓度为5×104个孢子/ml，100％保湿时间是24h；采用喷雾接种法、涂抹接种法、菌片贴接法进行接种试验；
2、选番茄材料“89”、“163”作为接种的抗、感病材料，采用喷雾接种法，孢子悬浮液浓度为5×104个孢子/ml，分别接种于苗龄为4叶期、6叶期、8叶期的番茄材料上，以无菌水接种“163”为对照，在人工气候室内100％保湿24h培养，7天后观察番茄材料的发病情况。
3、选番茄材料“89”、“163”作为接种的抗、感病材料，采用喷雾接种法，选取苗龄为5-6叶期的番茄植株，分别用孢子浓度为5×104个孢子/ml、7×104个孢子/ml、10×104个孢子/ml的孢子悬浮液接种抗、感病材料，并用无菌水接种的作为空白对照，分别设置24h、48h、72h、96h不同保湿时间的培养条件，于人工气候室内100％保湿培养，7天后观察植株的发病情况。
4、采用喷雾接种法，对番茄主栽品种和育种试材进行抗病性鉴定，完成抗性材料的筛选鉴定。接种的材料选用5～6叶期的番茄幼苗，接种浓度为7×104个孢子/ml，100％保湿24h，在人工气候室中进行，室温为22℃，7天后调查发病情况。每个处理重复3次，每次重复接种30株。
5、接种7天后，调查番茄材料的发病情况，根据病情分级标准：0级：叶片正常无病斑；1级：叶片有少量小病斑，病斑面积占全株叶片面积的1/4以下；2级：叶片有大量病斑，但植株叶片没有萎蔫、脱落，病斑面积占全株叶片面积的1/4～1/2；3级：叶片出现较大面积的病斑，叶片蜷缩，有部分叶片脱落，病斑面积占全株叶片面积的1/2～3/4；4级：全株萎蔫干枯或死亡，病斑面积占全株叶片面积的3/4以上。
根据植株病情指数，对植株进行抗病性分级，病情指数＝∑(各级病株数×相应级别)/(调查总株数×最高级别)×100，抗病性分级：病情指数0～15为高抗(hr)；病情指数15～30为抗病(r)；病情指数30～50为中抗(mr)；病情指数50～70为感病(s)；病情指数70～100为高感(hs)。发病最重的病情指数是100，无病时是0，所以病情指数能够表示发病的轻重。
6、研究结果为：喷雾接种法是人工接种最适宜的方法，简便易行，抗感差异明显；苗龄为6～8叶期的番茄幼苗是最佳接种时期，接种浓度为5×104个/ml，保湿48h抗感效果最好。对主栽品种和育种试材采用喷雾接种法进行抗性鉴定及筛选抗病品种，其中，筛选出3个抗病主栽品种(多丽、金冠五号和粉太郎5号)，5个中抗品种(金冠九号、佳宝十八、金圆宝抗ty新组合35、荷兰金粉番茄抗ty、倍盈)，其余主栽品种为感病和高感品种，育种试材全部为感病品种。
所述的步骤1中的喷雾接种法，包括以下步骤：用喷壶装有浓度为5×104个孢子/ml的孢子悬浮液喷洒在事先浇透准备的番茄材料“89”、“163”上，直到叶片饱和吐水为止，用无菌水喷洒番茄材料“163”作为对照。接种完的植株放在相同条件下100％保湿培养24h，24h后在室内正常湿度条件下培养6天，接种7天后观察植株的发病情况。
所述的步骤1中的涂抹接种法：用毛笔蘸取相同浓度的孢子悬浮液涂抹于番茄材料“89”、“163”的叶片表面及茎上，用另一只毛笔蘸取无菌水涂抹于另一组“163”植株上作为对照，用同样的方法在人工气候市内培养，7天后观察发病情况。
所述的步骤1中的菌片贴接法：用打孔器打取番茄灰叶斑病病原菌菌丝边缘生长旺盛的菌片，将带有菌丝的一面贴于番茄叶片背面，每个羽状复叶贴1个菌片，设无菌水涂抹为对照，100％保湿培养24h，接种7天后调查发病程度。
本发明的有益效果：此方法对接种技术进行系统的研究，为后续的抗病品种的选育和种质资源的筛选提供方便快捷方法，为深入研究番茄灰叶斑病抗病遗传育种工作奠定基础。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
实施例1：本实施例的供试材料由辽宁省农业科学院蔬菜所番茄遗传育种课题组提供，在人工气候室内进行试验。主栽品种有：粉果品种(金鹏一号、l-402、多丽、金冠五号、金冠九号、粉太郎5号、佳宝十八、金圆宝抗ty新组合29、金圆宝抗ty新组合35、荷兰金粉番茄抗ty)，红果品种(倍盈、凯美瑞、瑞菲、齐达利)，樱桃番茄(粉娘、园艺红玛瑙)。育种试材有：72号混、28号混、34号混、73号混抗ty、42号混抗ty、196号混、197号混、565号混。用来比较番茄灰叶斑病接种方法的番茄材料是“89”、“163”，在田间生产中“89”表现为抗性最强，“163”表现为抗性最差，用“89”和“163”分别作为抗病品种和感病品种，用无菌水接种的“163”作为空白对照。
供试病原菌为：从番茄灰叶斑病典型叶片上分离纯化的病原菌，将生长旺盛的菌丝接种于ca培养基上，用血球计数板法测量孢子数量配制一定浓度的孢子悬浮液，用于接种鉴定。
番茄育苗：番茄种子先用50℃-55℃热水浸泡15min消毒，再用温水浸种12h，催芽后有50％种子露芽时播种到灭菌土中，当幼苗长到4-5片真叶时用于接种鉴定。
一、番茄灰叶斑病接种技术研究
接种前，先选取合适苗龄的番茄材料，将营养钵用水浇透，带到人工气候室进行接种鉴定，室内温度为22℃左右，每天光照12h，并不定期浇水。每个处理重复3次，每次重复接种30株。
选用抗病材料“89”和感病材料“163”为试材，选取苗龄为7～8叶期的幼苗作为接种对象，接种浓度为5×104个孢子/ml，100％保湿时间是24h。采用喷雾接种法、涂抹接种法、菌片贴接法进行接种试验，
选番茄材料“89”、“163”作为接种的抗、感病材料，采用喷雾接种法，孢子悬浮液浓度为5×104个孢子/ml，分别接种于苗龄为4叶期、6叶期、8叶期的番茄材料上，以无菌水接种“163”为对照，在人工气候室内100％保湿24h培养，7天后观察番茄材料的发病情况。
选番茄材料“89”、“163”作为接种的抗、感病材料，采用喷雾接种法，选取苗龄为5-6叶期的番茄植株，分别用孢子浓度为5×104个孢子/ml、7×104个孢子/ml、10×104个孢子/ml的孢子悬浮液接种抗、感病材料，并用无菌水接种的作为空白对照，分别设置24h、48h、72h、96h不同保湿时间的培养条件，于人工气候室内100％保湿培养，7天后观察植株的发病情况。
二、番茄主栽品种及育种试材的抗病性鉴定
采用喷雾接种法，对番茄主栽品种和育种试材进行抗病性鉴定，完成抗性材料的筛选鉴定。接种的材料选用5～6叶期的番茄幼苗，接种浓度为7×104个孢子/ml，100％保湿24h，在人工气候室中进行，室温为22℃，7天后调查发病情况。每个处理重复3次，每次重复接种30株。
接种7天后，调查番茄材料的发病情况，根据病情分级标准：0级：叶片正常无病斑；1级：叶片有少量小病斑，病斑面积占全株叶片面积的1/4以下；2级：叶片有大量病斑，但植株叶片没有萎蔫、脱落，病斑面积占全株叶片面积的1/4～1/2；3级：叶片出现较大面积的病斑，叶片蜷缩，有部分叶片脱落，病斑面积占全株叶片面积的1/2～3/4；4级：全株萎蔫干枯或死亡，病斑面积占全株叶片面积的3/4以上。
根据植株病情指数，对植株进行抗病性分级，病情指数＝∑(各级病株数×相应级别)/(调查总株数×最高级别)×100，抗病性分级：病情指数0～15为高抗(hr)；病情指数15～30为抗病(r)；病情指数30～50为中抗(mr)；病情指数50～70为感病(s)；病情指数70～100为高感(hs)。发病最重的病情指数是100，无病时是0，所以病情指数能够表示发病的轻重。
三、结果与分析
1、番茄灰叶斑病接种技术研究
1.1研究适宜的接种方法结果分析
用3种接种方法分别接种孢子浓度为5×104个孢子/ml，100％保湿24h，7天后调查不同接种方法植株的发病情况，结果表现为：接种第4天三种方法接种的番茄植株“163”材料都开始发病，出现病斑，但是三者发病程度不同，喷雾接种法发病最重，其次是涂抹接种法，菌片贴接法发病最轻(如表1)，“89”材料和无菌水对照均没有发病，第七天调查发病情况得到：喷雾接种法、涂抹接种法和菌片贴接法的“89”和无菌水对照病情级数都是0级，没有发病，植株正常生长，“89”表现为对番茄灰叶斑病高抗。“163”的发病情况为喷雾法发病最重，达到98％发病，病情级数为4级，茎也有轻微发病，全株萎蔫干枯，植株基本停止生长；涂抹法病情级数为3级，叶片下部基本都已枯萎，上部叶片都有病斑，全株叶片长势弱；菌片贴接法发病最轻，病情级数仅为1级，叶片只有少量病斑，对植株生长影响小，但与“89”相比，长势不如“89”旺盛。由此可见，对于人工接种方法最适宜的是喷雾接种法，不仅方便快捷，而且能够很好的筛选抗病材料。
表1不同接种方法番茄幼苗的病情指数
注:字母hr表示高抗，r表示抗病，s表示感病。hs表示高感。
1.2研究适宜的接种苗龄结果分析
接种4叶期、6叶期、8叶期的抗感材料，结果显示，4叶期、6叶期、8叶期苗龄的抗病品种都表现了良好的抗性，病情级数为0级，对照材料也没有任何病状，感病材料“163”在不同苗龄抗性有差异，4叶期感病材料发病较轻，病情级数为1级，只有少量的病斑，植株矮化；6叶期感病材料下部叶片大多干枯脱落，上部叶片也有被侵染发病，病情级数为2级和3级，植株与抗病材料相比明显矮化。8叶期感病材料发病较重，病情级数为4级，整株干枯萎蔫，与抗病材料区分明显(如表2)。因此，6叶期和8叶期是适宜的接种时期。
表2不同苗龄接种番茄灰叶斑病病菌的病情指数
1.3不同孢子浓度和保湿时间对番茄材料发病程度的影响
根据调查结果发现，在相同的保湿时间条件下，孢子浓度越大，感病材料发病越严重，但是在相同的孢子浓度下，并不是保湿时间越长，抗感效果越明显，24h和48h保湿，在三种孢子浓度下都可以很好的区分抗、感材料，但在72h和96h，保湿时间过长，抗病植株轻度发病，徒长、萎蔫、倒伏现象严重，抗感效果不好。因此，5～6叶期苗龄的番茄材料适宜的接种浓度和保湿时间是5×104个孢子/ml保湿48h和7×104个孢子/ml保湿24h。(如表3所示)
表3不同孢子浓度和保湿时间处理的番茄幼苗的病情指数
2、番茄主栽品种及育种试材的抗病性鉴定
2.1番茄主栽品种的抗病性鉴定结果
如表4所示，采用喷雾接种法对16个主栽品种的抗病性鉴定分析结果表明，16个主栽品种中，部分粉果品种的感病较轻，如多丽、金冠五号、粉太郎5号等品种，表现了一定的抗病性。金冠九号、佳宝十八、金圆宝抗ty新组合35、荷兰金粉番茄抗ty、倍盈这5个主栽品种表现为中抗，病情级数为2级。金圆宝抗ty新组合29和齐达利都表现为高感，但齐达利比金圆宝抗ty新组合29病情指数高，齐达利植株大部分都萎蔫死亡，病情分级为4级，而金圆宝抗ty新组合29的病情分级为3～4级。其余主栽品种抗病表现为感病，病情级数3级。
表4不同番茄主栽品种的病情指数
2.2番茄育种试材的抗病性鉴定结果
由表5可知，8个育种试材抗病表现均为感病，其中72号混、28号混、34号混、196号混、197号混、565号混表现为高感，病情级数为3～4级。73号混抗ty和42号混抗ty表现为感病，病情级数为2～3级。
表5不同番茄育种试材的病情指数
本实施例以“89”为抗病材料，“163”为感病材料，对番茄灰叶斑病病原菌接种技术进行系统研究，研究结果为：喷雾接种法是人工接种最适宜的方法，简便易行，抗感差异明显；苗龄为6～8叶期的番茄幼苗是最佳接种时期，接种浓度为5×104个/ml，保湿48h抗感效果最好。对主栽品种和育种试材采用喷雾接种法进行抗性鉴定及筛选抗病品种，其中，筛选出3个抗病主栽品种(多丽、金冠五号和粉太郎5号)，5个中抗品种(金冠九号、佳宝十八、金圆宝抗ty新组合35、荷兰金粉番茄抗ty、倍盈)，其余主栽品种为感病和高感品种，育种试材全部为感病品种。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。