本发明涉及生物工程
技术领域：
，更具体地涉及一种提高虫草素、虫草酸和虫草多糖含量的蛹虫草人工培养方法。
背景技术：
：蛹虫草(cordycepsmilitaris)，又叫北冬虫夏草、北虫草，简称蛹草，属于子囊亚门、核菌纲、球壳菌目、麦角菌科、虫草属，是寄生于一种鳞翅目蝙蝠科昆虫虫草蝙蝠蛾幼虫上的子座或其他种别的蝙蝠科昆虫幼虫上的复合体，具有抗肿瘤、抗炎、抗病毒、增强机体免疫力、增强巨噬细胞活性等功效，是我国名贵中药材之一。蛹虫草中含有虫草素、虫草酸、虫草多糖、蛋白质、氨基酸、维生素、矿物质等营养成分，其中，虫草素、虫草酸和虫草多糖是蛹虫草特有的物质，是蛹虫草特殊功效的主要指标。虫草素(cordycepin)又名3＇-脱氧腺苷，是蛹虫草中主要的有效成分之一，临床上主要用于治疗癌症、白血病、扩张支气管、显著增强肾素、抗衰老等作用。虫草酸含量的高低是衡量虫草质量的主要标准之一，一般认为虫草酸含量高的蛹虫草药用价值高。虫草酸可预防治疗脑血栓、脑出血、心肌梗塞、长期衰竭，抗肝组织纤维化，抗脂质过氧化。虫草多糖可提高人体免疫功能，升高白细胞，改善呼吸系统，有促进肾上腺的作用抑制肿瘤生长，并具有抗肿瘤、抗辐射、降血糖和脂蛋白、止咳、化痰、润肺和延缓衰老等药理作用，临床已用于治疗恶性肿瘤。蛹虫草的人工培养有人工固体培养技术和液体发酵培养等培养技术。目前，提高虫草属虫草素含量的方法有两类，一类是通过菌株的诱变育种方式，提高原有菌种的虫草素含量水平，另一类是通过培养条件优化和培养过程中添加诱导物的方法提高虫草素含量，中国发明专利cn102630490b通过添加较高浓度的锰离子诱导蛹虫草提高虫草素含量，采用此技术方案获得的蛹虫草的虫草素较之未添加锰离子诱导的虫草素含量增加了2.3倍，但也仍处于较低水平。提高蛹虫草的虫草酸和虫草多糖含量的方法均主要通过液体的深层发酵来提高，但是，深层发酵得到的为蛹虫草的菌丝体，其产生的虫草酸的含量一般在3～4.5％左右，并且发酵得到的培养物不仅包括蛹虫草自身，还含有一些培养基残渣，影响虫草酸和虫草多糖的纯度。技术实现要素：为此，需要提供一种蛹虫草的培养方法，以解决目前人工培养蛹虫草虫草素、虫草酸和虫草多糖含量较低的问题。为实现上述目的，发明人提供了一种蛹虫草的培养方法，包括以下步骤：培养菌丝：将蛹虫草孢子悬液接种于蛹虫草菌丝培养基中，先在避光条件下通高氧空气培养7～11d，再在光照条件下继续通高氧空气培养3d，得到蛹虫草菌丝；培养子实体：将所述蛹虫草菌丝接种于蛹虫草生长培养基中，在光照条件下通高氧空气培养60～80d，所述蛹虫草生长培养基按重量份计为800～1800份大米饭，得到蛹虫草子实体。本发明所采用的蛹虫草孢子悬液为：将市面上购买或购自中国工业微生物菌种保藏管理中心的蛹虫草菌种(编号：cicc14013)接种于蛹虫草种子培养基中，按照常规方法培养，得到蛹虫草菌株，再从上述蛹虫草菌株中按常规方法分离单子囊孢子，即将菌种置于常规培养基中培养出菌株，在无菌条件下用灭菌牙签挑取少量粉色孢子置于pd液体培养基中制备孢子悬液或者自由配对的蛹虫草菌株经培养得到的分生孢子置于pd液体培养基中制备得到的，将上述单子囊孢子或分生孢子按照常规方法进行活化培养，制得含量为1.0×107cfu/ml的蛹虫草孢子悬液，接着将所述蛹虫草孢子悬液按所述培养菌丝和培养子实体步骤进行培养。孢子萌发和菌丝生长阶段，均不需要光照，以利于产生子座。孢子悬液在吸收所述蛹虫草菌丝培养基中的营养成分时，需要适当补入新鲜空气以防止二氧化碳积累过多，阻碍菌丝产生子座。发明人通过大量对比试验发现，直接通入高含氧量空气比振荡补入新鲜空气，对于菌丝体的生长更能满足菌丝的生长需要。特别低，本发明在培养菌丝时，有别于传统的避光摇床振荡培养，本发明先将蛹虫草孢子悬液接种于蛹虫草菌丝培养基中，先在避光条件下通高氧空气培养7～11d，再在光照条件下继续通高氧空气培养3d，这样做的好处一是为了激活菌丝体，二是为了更好地将菌丝体吸收的营养转化成活性成分，省去了制备种子液的步骤，由于通入了高含氧空气，7～11d便得到大量蛹虫草菌丝，与传统方法需要18～25d才能得到菌丝的周期相比，时间大大缩短，再将所述活化的蛹虫草菌丝接种于蛹虫草生长培养基中进行光照通高含氧空气子实体培养，所得到的蛹虫草子实体虫草素、虫草酸和虫草多糖的含量均大于传统摇床振荡培养的产品。子实体的生殖生长阶段需要明亮的光照，为了得到品质优良的蛹虫草子实体，本发明采用光照强度为200～240lux，在通入含氧量大于等于80％的空气，气体流量为100～180vvm的条件下，将菌丝接种在大米饭中，让菌丝最大限度地利用大米中的营养成分，生长速率和活性成分含量都得到较大提高。大米之间的空隙为高氧空气和大米养分的充分利用创造了很好的条件，缩短子实体的生长周期，也使蛹虫草子实体的虫草素、虫草酸和虫草多糖纯度更高。进一步地，所述培养菌丝步骤中，培养条件为：当通入含氧量大于等于80％的空气时，将气体温度调整为14～18℃，不通气时调整温度为18～22℃。进一步地，通入含氧量大于等于80％空气的工艺条件如下：气体流量为100～180vvm，通气时间为1.5～2.5h/次，每天通气4～6次。进一步地，光照通高氧空气培养时，光照强度为200～500lux。人工栽培蛹虫草的产量和质量取决于菌种和栽培条件，菌种的遗传效应也会产生一定限制作用，光线和培养温度也是重要因素。于培养前避光培养有利于蛹虫草菌丝的生长和虫草素、虫草酸和虫草多糖的转化形成，而后期必须见光才有利于子实体形成，栽培于适当温度，有利于抑制污染菌的生长，且提高产量，但温度过低则使栽培周期延长，通过反复试验验证，在通入高氧空气时，调整气体温度为14～18℃，能够充分激活蛹虫草细胞，在不通入高氧空气时，需要将温度调整为18～22℃，这样的温差会使其在高氧空气环境下积累更多的活性物质。蛹虫草菌丝体生长阶段的前期不需要光照，强光照对菌丝生长有抑制作用，子实体分化阶段则需要适当的光照处理，子实体的生长过程中，光照度、温度与子实体中的虫草素含量呈正相关。进一步地，当通入含氧量大于等于80％的空气时，气体流量为100～180vvm，通气时间为1.5～2.5h/次，每天通气4～6次。通入高含氧量空气时需根据菌丝生长情况把握通气时间，否则，若培养基中营养成分消耗殆尽，继续通入氧气对于菌丝生长没有正向促进作用，而且浪费了通气成本，经试验观察得知，一次通气时间为1.5～2.5h效果最佳。进一步地，所述培养子实体步骤中，培养条件如下：当通入含氧量大于等于80％的空气时，调整气体温度为14～18℃，光照强度为200～1200lux下，不通气时，调整温度为18～22℃。类似培养菌丝步骤，在通高氧空气时调整气体温度为14～18℃，而不通气时调整温度为18～22℃，能够最大限度地刺激子实体的活性物质积累和加快生长。进一步地，所述蛹虫草菌丝培养基，按重量份计，包括以下成分：马铃薯粉7～14份、净水600～1500份、葡萄糖7～14份、蛋白胨2～5份、硫酸镁0.01～0.05份、磷酸二氢钾0.01～0.05份和维生素b10.01～0.10份。本发明蛹虫草菌丝培养采用液体培养基，具有如下优点：一是菌丝生长速度快，菌丝体产量高，二是可以提高蛹虫草的代谢产物虫草素、虫草酸和虫草多糖的产量，而且液体培养克服了直接从蛹虫草子实体中提取代谢产物劳动量大、耗时多、产量低等缺点，三是便于工业化生产。碳源是蛹虫草合成碳水化合物和氨基酸的基础，也是重要的能量来源。人工栽培时，蛹虫草可利用的碳源有葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉、果胶等，其中尤以葡萄糖、蔗糖等小分子糖类的利用效果最好。本发明采用葡萄糖和马铃薯粉作为蛹虫草活化和菌丝生长的碳源，以大米作为子实体生长的碳源，能量和碳元素利用效率最高，而且在子实体通光照通高氧空气培养时，大米之间的空隙为高氧空气和大米养分的充分利用创造了很好的条件，缩短子实体的生长周期，也使蛹虫草子实体的虫草素、虫草酸和虫草多糖纯度更高。氮元素是蛹虫草自身合成的蛋白质、核酸等有机氮以及铵盐等无机氮的重要元素，其中，有机氮源优于无机氮源，能利用的有机氮很多，如氨基酸、蛋白胨、豆饼粉、蚕蛹粉等，本发明通过筛选比对，仍采用常规的蛋白胨作为有机氮元素供体。蛹虫草为偏酸性真菌，其菌丝生长发育最适ph为5.2～6.8，但在灭菌和培养过程中ph值会下降。所以在配制培养基时，应调高ph值1～1.5，在配制培养基时可加适量的磷酸二氢钾等缓冲物质，调控培养基中的ph值并提供矿物质。虫草菌丝不能合成必要的维生素，适当加入维生素b1有利于菌丝的生长发育。矿物质元素中的k+、mg+、ca2+等以及一些生物素可促进蛹虫草菌丝和子实体的生长。进一步地，所述蛹虫草孢子悬液含量为1.0×107cfu/ml。区别于现有技术，上述技术方案将蛹虫草孢子悬液接种于蛹虫草菌丝培养基中，通入高含氧空气先进行暗培养、在菌丝培养的最后三天在同样培养基中进行光照培养得到菌丝，省去了将孢子扩培制备种子液的步骤，由于通入了高含氧空气，10～14天便得到大量菌丝，与传统方法需要18～25天才能得到菌丝的周期相比，时间大大缩短，再将所述菌丝接种于蛹虫草生长培养基中进行光照通高含氧空气子实体培养，所得到的蛹虫草子实体虫草素含量为9.6mg/g、虫草酸含量为2.4％和虫草多糖体干重为5.8，而传统振荡培养得到的子实体虫草素含量为5.0mg/g、虫草酸含量为2.0％和虫草多糖体干重为4.4。具体实施方式为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例详予说明。实施例一本实施例提供一种通入高含氧空气培养蛹虫草的方法，具体步骤为：蛹虫草菌种购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号cicc14013。分离单子囊孢子：将上述蛹虫草菌种接种于蛹虫草种子培养基中，所述蛹虫草种子培养基按重量份计，包括以下成分：马铃薯粉10份、净水1000份、葡萄糖7份、蛋白胨3份、琼脂10份、维生素b10.05份、维生素b20.03份、磷酸二氢钾0.02份和硫酸镁0.03份，避光培养7天，得到蛹虫草菌株，在无菌条件下用灭菌牙签从优势蛹虫草菌株中挑出单子囊孢子；制备孢子悬液：将所述单子囊孢子置于无菌水中，制得含量为1.0×107cfu/ml的孢子悬液；培养菌丝：将所述孢子悬液接种于蛹虫草菌丝培养基中进行高含氧空气通气先进行暗培养8天，再在光照400lux下培养3天，观察菌丝体的颜色，待其变成橘红色菌丝球时，停止通气，得到菌丝，所述蛹虫草菌丝培养基，按重量份计，包括以下成分：马铃薯粉7份、净水700份、葡萄糖8份、蛋白胨3份、硫酸镁0.02份、磷酸二氢钾0.01份和维生素b10.05份，在16℃下，以100vvm的气体流量通入含氧量等于80％的空气进行培养，通气时长为1.5h/次，每天通气5次，停止通气后，将气体温度调整为21℃；培养子实体：将所述菌丝接种于蛹虫草生长培养基中进行通高氧空气光照子实体培养，所述蛹虫草生长培养基按重量份计为1000份大米饭，调整气体温度为14℃，以120vvm的气体流量通入含氧量为85％的空气进行培养，通气时长为2h/次，不通气时，调整温度为19℃，在光照强度为1000lux，培养60天，待蛹虫草子实体长度为8～10cm，即可收割。实施例二本实施例提供一种通入普通空气进行蛹虫草人工培养的方法。本实施例与实施例一不同的是，培养菌丝步骤全部为暗培养，培养11d。其余条件相同。实施例三本实施例与实施例一不同的是，培养菌丝步骤和培养子实体步骤通入的是普通空气，其余条件相同。实施例四本实施例与实施例三不同的是，培养菌丝步骤在避光条件下通入普通空气，其余条件相同。实施例五本实施例提供一种振荡培养蛹虫草的方法，具体步骤为：蛹虫草菌种购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号cicc14013，制备孢子悬液的步骤同实施例一。不同的是，本实施例采用传统的摇床振荡法培养种子液：将所述孢子悬液接种于常规pda液体培养基中，在23℃条件下避光培养7天，得到种子液；培养菌丝：将所述种子液接种于蛹虫草菌丝培养基中进行振荡培光照400lux培养11天，在26℃下，以250rpm/min振荡培养，观察菌丝体的颜色，待其变成橘红色菌丝球时，停止振荡，得到菌丝，所述蛹虫草菌丝培养基，按重量份计，包括以下成分：马铃薯粉7份、净水700份、葡萄糖8份、蛋白胨3份、硫酸镁0.02份、磷酸二氢钾0.01份和维生素b10.05份；培养子实体：将所述菌丝接种于蛹虫草生长培养基中进行光照子实体培养，所述蛹虫草生长培养基按重量份计为1000份大米饭，每天通风3h，施以光照强度1000lux光照8h，培养60天，至子实体长度为8～12cm，即可采收蛹虫草子实体。实施例六本实施例提供一种振荡培养蛹虫草菌丝的方法，具体步骤与实施例五不同的在于，培养菌丝体步骤为振荡避光条件培养，不通入高氧空气或普通空气，其余步骤与实施例二相同。按照实施例一至实施例六的技术方案所得到的蛹虫草菌丝的虫草素、虫草酸的含量如表1和表2所示，分别通高氧空气、普通空气和不通空气振荡摇床培养得到的菌丝体干重和多糖体干重含量如表3和表4所示。表1实施例一至实施例六中所得到的蛹虫草菌丝虫草素含量(mg/g)天数1357911实施例一0.421.966.869.6412.812.5实施例二0.230.681.403.334.244.19实施例三0.311.303.255.045.575.43实施例四0.170.400.791.963.283.12实施例五00.951.101.291.501.23实施例六00.130.771.151.001.00表2实施例一至实施例六中所得到的蛹虫草菌丝虫草酸含量(g/100g)天数1357911实施例一0.11.61.82.43.13.1实施例二0.11.21.51.41.61.5实施例三0.11.51.42.02.52.4实施例四0.11.51.61.61.71.6实施例五01.01.31.31.61.5实施例六00.71.41.31.61.5表3通高氧空气、普通空气及不通空气振荡摇床培养所得到的蛹虫草菌丝体干重(％)表4通高氧空气、普通空气及不通空气振荡摇床培养所得到的多糖体干重(％)由表1和表2结果可知，总体上，通高氧空气培养的菌丝中虫草素和虫草酸的含量最高，通普通空气培养的次之，振荡摇床培养的最低，在光照和暗培养的对比中，同样是通高氧空气，在培养的最后三天给予光照，所得到的菌丝中虫草素和虫草酸的含量也较高，同样的规律也出现在通入普通空气和振荡摇床培养的方案中。由表3和表4的结果可知，通高氧空气、普通空气及不通空气振荡摇床培养所得到的蛹虫草菌丝体干重和多糖体干重呈现出高到低的规律，随着培养天数的增加蛹虫草菌丝体干重和多糖体干重均随着增加，但到第9天之后不再继续增加，虫草素和虫草酸含量也有此规律出现，采用本发明最优的技术方案，培养出的蛹虫草具有如下优点：每克蛹虫草菌丝中虫草素的含量为12.8mg，每100g蛹虫草菌丝中虫草酸的含量为3.1g，蛹虫草菌丝的干重为8.4％，多糖体干重为5.7％。实施例七与实施例一不同的是，在每次进行通入高氧空气时，调整气体温度为18℃，以180vvm的气体流量通入含氧量等于99％的空气进行培养，通气时间为2.5h/次，不通气时调整温度为22℃，在培养菌丝中的光照培养时，光照强度调整到200lux，在培养子实体中的光照培养时，光照强度调整到1100lux。同样地，在不同的其他实施例中，培养菌丝步骤中，通高氧空气时气体温度可以在14～18℃范围调整，不通气时温度可以在18～22℃范围调整，光照强度可以在200～500lux范围调整，气体流量可以在100～180vvm范围调整，培养子实体时，通高氧空气时温度可以在14～18℃范围调整，不通气时温度可以在18～22℃范围调整，光照强度可以在200～1200lux范围调整，气体流量可以在100～180vvm范围调整。以上的最优方案所得到的蛹虫草，每克蛹虫草菌丝中虫草素的含量为12.8mg，每100g蛹虫草菌丝中虫草酸的含量为3.1g，蛹虫草菌丝的干重为8.4％，多糖体干重为5.7％。需要说明的是，尽管在本文中已经对上述各实施例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施例进行的变更和修改，或利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的
技术领域：
，均包括在本发明的专利保护范围之内。当前第1页12