一种葛根试管薯离体诱导方法与流程

本发明属于葛根的培育技术领域，具体涉及一种葛根试管薯离体诱导方法。

背景技术

葛根又叫葛藤、葛麻藤、粉葛，为豆科葛属藤本植物，富含淀粉，是中国卫生部首批批准的药食同源两用植物，素有“北参南葛”、“亚洲人参”之美誉。葛根是以地下贮藏块根为主要经济收获器官，所以研究葛根贮藏块根发生发育具有重要意义。由于葛根块根从苗期到成熟期需要9～10个月，且块根生长在土壤中，研究观察耗时长且不方便取材。目前，有关葛根试管薯的诱导国内外未见报道。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种葛根试管薯的离体诱导方法，诱导周期短，诱导效率高。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种葛根试管薯离体诱导方法，包括以下步骤：

1)将葛根组培苗接种到生根培养基中进行生根培养，得生根苗；所述生根培养基以1/2ms培养基为基本培养基，还包括：0.02～0.05mgl的naa、25～36g/l的蔗糖和4～8g/l的琼脂；

2)将步骤1)得到的所述生根苗接种于试管薯诱导培养基中进行诱导培养，得葛根试管薯；所述诱导培养基以ms培养基为基本培养基，还包括：1～3.5mg/l的6-ba、0.01～0.05mg/l的naa、1～10μmol/l的ja、70～90g/l的蔗糖和4～8g/l的琼脂。

优选的，步骤1)所述葛根组培苗的制备方法，包括：

a)以葛根幼嫩组织为外植体，消毒后接种于初代培养基中进行初代培养，得无菌苗；所述初代培养基以ms培养基为基本培养基，还包括：0.1～0.3mg/l的6-ba、0.02～0.1mg/l的naa、25～38g/l蔗糖和4～8g/l的琼脂；

b)将步骤a)得到的所述无菌苗接种于增殖培养基中进行增殖培养，得丛生苗；所述增殖培养基以ms培养基为基本培养基，还包括：0.01～0.05mg/l的6-ba、0.02～0.1mg/l的naa、26～32g/l的蔗糖和4～8g/l的琼脂；

c)将步骤b)得到的所述丛生苗单芽分离后得葛根组培苗。

优选的，步骤a)所述幼嫩组织包括幼嫩茎蔓。

优选的，步骤a)所述初代培养为光照培养，所述初代培养的光照时间为11～20h/d，光照强度为1500～2000lx；所述初代培养的温度为22～28℃，所述初代培养的时间为28～35d。

优选的，步骤b)所述增殖培养为光照培养，所述增殖培养的光照时间为11～20h/d，光照强度为1500～2000lx；所述增殖培养的温度为22～28℃，所述增殖培养的时间为25～30d。

优选的，步骤1)所述生根培养为暗培养，所述生根培养的培养温度为22～28℃，培养时间为5～7d。

优选的，步骤1)所述生根苗的根长为0.5～1cm。

优选的，步骤2)所述诱导培养为光照培养，所述诱导培养的光照时间为11～20h/d，光照强度为1500～2000lx；所述诱导培养的温度为22～28℃，所述诱导培养的时间为20～25d。

本发明提供了一种葛根试管薯离体诱导方法，以葛根组培苗为材料进行葛根薯的离体诱导，可明显提高试管薯诱导率，缩短试管薯诱导时间，培养25～30d所述葛根组培苗，试管薯诱导效率可高达95％以上，且诱导条件不受季节的限制，可实现周年结薯。

附图说明

图1为本发明实施例1所诱导出的葛根试管薯图。

具体实施方式

本发明提供了一种葛根试管薯离体诱导方法，包括以下步骤：

1)将葛根组培苗接种到生根培养基中进行生根培养，得生根苗；所述生根培养基以1/2ms培养基为基本培养基，还包括：0.02～0.05mgl的naa、25～36g/l的蔗糖和4～8g/l的琼脂；

2)将步骤1)得到的所述生根苗接种于试管薯诱导培养基中进行诱导培养，得葛根试管薯；所述诱导培养基以ms培养基为基本培养基，还包括：1～3.5mg/l的6-ba、0.01～0.05mg/l的naa、1～10μmol/l的ja、70～90g/l的蔗糖和4～8g/l的琼脂。

在本发明所述葛根试管薯离体诱导方法中，将葛根组培苗接种到生根培养基中进行生根培养，得生根苗；所述生根培养基以1/2ms培养基为基本培养基，还包括：0.02～0.05mg/l的naa、25～36g/l的蔗糖和4～8g/l的琼脂。本发明所述葛根组培苗的制备方法，优选包括：

a)以葛根幼嫩组织为外植体，消毒后接种于初代培养基中进行初代培养，得无菌苗；所述初代培养基以ms培养基为基本培养基，还包括：0.1～0.3mg/l的6-ba、0.02～0.1mg/l的naa、25～38g/l蔗糖和4～8g/l的琼脂；

b)将步骤a)得到的所述无菌苗接种于增殖培养基中进行增殖培养，得丛生苗；所述增殖培养基以ms培养基为基本培养基，还包括：0.01～0.05mg/l的6-ba、0.02～0.1mg/l的naa、26～32g/l的蔗糖和4～8g/l的琼脂；

c)将步骤b)得到的所述丛生苗单芽分离后得葛根组培苗。

在本发明所述葛根试管苗的制备方法中，以葛根幼嫩组织为外植体，消毒后接种于初代培养基中进行初代培养，得无菌苗；所述初代培养基以ms培养基为基本培养基，还包括：0.1～0.3mg/l的6-ba、0.02～0.1mg/l的naa、25～38g/l蔗糖和4～8g/l的琼脂。本发明所述幼嫩组织优选包括幼嫩茎蔓，本发明对所述幼嫩组织的来源并没有特殊限定，优选选取生长健壮、无病虫害植株的幼嫩茎蔓，并剪掉其叶片。本发明所述消毒优选包括将所述外植体置于含洗洁精的水溶液中浸泡15～20min，取出后清洗干净；再置于质量浓度为0.1％的升汞溶液中浸泡6～10min，取出，冲洗4～5次。本发明对所述含洗洁精的水溶液的浓度并没有特殊限定，利用本领域的常规含洗洁精水溶液即可。本发明在所述含洗洁精的水溶液中浸泡时，优选包括用软毛刷清洗表面污垢。本发明所述升汞溶液浸泡优选在无菌条件下进行，更优选在超净工作台中进行。本发明所述升汞溶液的浸泡时间优选为7～9min，更优选为8min。本发明所述初代培养基中包含6-ba，所述6-ba在所述初代培养基中的浓度优选为0.12～0.28mg/l，更优选为0.18～0.25mg/l，最优选为0.2mg/l。

本发明所述初代培养基中包含naa，所述naa在所述初代培养基中的浓度优选为0.03～0.08mg/l，更优选为0.04～0.06mg/l，最优选为0.05mg/l。本发明所述初代培养基中包含蔗糖，所述蔗糖在所述初代培养基中的浓度优选为27～35g/l，更优选为28～32g/l，最优选为30g/l。本发明所述初代培养中包含琼脂，所述琼脂在所述初代培养基中的浓度优选为4～8g/l，更优选为5～7g/l，最优选为6g/l。本发明对所述初代培养基中的各原料来源并没有特殊限定，利用本领域的常规试剂即可。本发明所述初代培养优选为光照培养，所述光照培养的光照时间优选为11～20h/d，更优选为13～18h/d，最优选为16h/d。本发明所述初代培养的光照强度优选为1500～2000lx，更优选为1600～1850lx，最优选为1800lx。本发明所述初代培养的温度优选为22～28℃，更优选为24～26℃，最优选为25℃。本发明所述初代培养的时间优选为28～35d，更优选为29～32d，最优选为30d。本发明所述初代培养即可将外植体诱导成无菌苗。

得无菌苗后，本发明将所述无菌苗接种于增殖培养基中进行增殖培养，得丛生苗；所述增殖培养基以ms培养基为基本培养基，还包括：0.01～0.05mg/l的6-ba、0.02～0.1mg/l的naa、26～32g/l的蔗糖和4～8g/l的琼脂。本发明所述增殖培养基包含6-ba，所述6-ba在所述增殖培养基中的浓度优选为0.02～0.04mg/l，更优选为0.03mg/l。本发明所述增殖培养基中包含naa，所述naa的在所述增殖培养基中的浓度优选为0.03～0.08mg/l，更优选为0.04～0.06mg/l，最优选为0.05mg/l。本发明所述增殖培养基中包含蔗糖，所述蔗糖在所述增殖培养基中的浓度优选为27～31.5g/l，更优选为28～31g/l，最优选为30g/l。本发明所述增殖培养中包含琼脂，所述琼脂在所述增殖培养基中的浓度优选为4～8g/l，更优选为5～7g/l，最优选为6g/l。本发明对所述增殖培养基中的各原料来源并没有特殊限定，利用本领域的常规试剂即可。本发明所述增殖培养优选为光照培养，所述光照的时间优选为11～20h/d，更优选为13～18h/d。最优选为16h/d。本发明所述增殖培养的光照强度优选为1500～2000lx，更优选为1600～1850lx，最优选为1800lx。本发明所述增殖培养的温度优选为22～28℃，更优选为24～26℃，最优选为25℃。本发明所述增殖培养的周期优选为25～30d，更优选为26～29d，最优选为28d。本发明所述增殖培养的增殖率为11.3。

得丛生苗后，本发明将所述丛生苗单芽分离后得葛根组培苗。本发明对所述单芽分离的方法并没有特殊限定，利用本领域的常规范例方法即可。

得葛根组培苗后，本发明将所述葛根组培苗接种到生根培养基中进行生根培养，得生根苗；所述生根培养基以1/2ms培养基为基本培养基，还包括：0.02～0.05mg/l的naa、25～36g/l的蔗糖和4～8g/l的琼脂。本发明所述生根培养基中包含naa，所述naa在所述生根培养基中的浓度优选为0.025～0.046mg/l，更优选为0.03～0.04mg/l，最优选为0.035mg/l。本发明所述生根培养基中包含蔗糖，所述蔗糖在所述生根培养基中的浓度优选为26～34g/l，更优选为29～32g/l，最优选为30g/l。本发明所述生根培养基中包含琼脂，所述琼脂在所述生根培养基中的浓度优选为4.5～7.2g/l，更优选为5.6～6.5g/l，最优选为6g/l。本发明所述生根培养基优选为半固体培养基。本发明对所述生根培养基的各原料的来源并没有特殊限定，利用本领域的常规试剂即可。本发明所述生根培养优选为暗培养，所述暗培养的温度优选为22～28℃，更优选为24～26℃，最优选为25℃。本发明所述生根培养的时间优选为5～7d。本发明所述生根培养的生根率为97％，在所述生根培养5～7d时，生根苗的根长可达到0.5～1cm。

得生根苗后，本发明将所述生根苗接种于诱导培养基中进行诱导培养，得葛根试管薯；所述诱导培养基以ms培养基为基本培养基，还包括：1～3.5mg/l的6-ba、0.01～0.05mg/l的naa、1～10μmol/l的ja、70～90g/l的蔗糖和4～8g/l的琼脂。本发明所述诱导培养基中包含有6-ba，所述6-ba在所述诱导培养基中的浓度优选为1.2～3mg/l，更优选为1.8～2.5mg/l，最优选为2mg/l。本发明所述诱导培养基中包含有naa，所述naa在所述诱导培养基中的浓度优选为0.012～0.04mg/l，更优选为0.016～0.03mg/l，最优选为0.02mg/l。本发明所述诱导培养基中包含ja，所述ja在所述诱导培养基中的浓度优选为2～8μmol/l，更优选为3～6μmol/l，最优选为5μmol/l。本发明所述诱导培养基中包含蔗糖，所述蔗糖在所述诱导培养基中的浓度优选为75～88g/l，更优选为78～83g/l，最优选为80g/l。本发明所述诱导培养基中包含琼脂，所述琼脂在所述诱导培养基中的浓度优选为4.5～7.2g/l，更优选为5.6～6.5g/l，最优选为6g/l。本发明对所述诱导培养基中各原料的来源并没有特殊限定，利用本领域的常规试剂即可。本发明所述诱导培养优选为光照培养，所述光照培养的光照时间优选为11～20h/d，更优选为14～18h/d，最优选为16h/d。本发明所述诱导培养的光照强度优选为1500～2000lx，更优选为1700～1900lx，最优选为1800lx。本发明所述诱导培养的温度优选为22～28℃，更优选为24～26℃，最优选为25℃。本发明所述诱导培养的时间优选为20～25d，更优选为22～24d，最优选为23d。本发明所述葛根薯的诱导率为95％以上。

下面结合实施例对本发明提供的葛根试管薯离体诱导方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

选取生长健壮、无病虫害植株的幼嫩茎蔓，剪掉其叶片后放入加有洗洁精的水中浸泡15min，用软毛刷清洗表面污垢，在流水中冲洗20min。

在超净工作台上，用0.1％hgcl2浸泡处理8min，再用无菌水冲洗5次，用无菌滤纸吸干外植体表面水分。

在无菌条件下，将茎段切成1.2cm长带一个腋芽的茎段，将生物学下端垂直竖插于初代培养基ms+0.2mg/l6-ba+0.05mg/lnaa+30.0g/l蔗糖+6.0g/l琼脂(ph，5.8)中进行培养。培养条件：培养温度(25±1)℃，光照强度1800lx，光照时间为16h/d。

培养4周后，将初代培养的无菌苗单芽茎段转入继代增殖培养基ms+0.03mg/l6-ba+0.05mg/lnaa+30.0g/l蔗糖+6.0g/l琼脂(ph，5.8)。培养条件：培养温度(25±1)℃，光照强度1800lx，光照时间为16h/d。每25天为一个循环继代周期，即获得葛根组培苗。

将无菌葛根组培苗转接到生根培养基1/2ms+naa0.02mg/l+蔗糖30g/l+琼脂粉6g/l的半固体培养基中进行生根培养5d，培养条件为暗培养，培养温度(25±1)℃。待根长为0.5cm时，转入试管薯诱导培养基ms+6-ba2mg/l+naa0.02mg/l+ja1μmol/l+蔗糖80g/l+琼脂粉6g/l，培养条件为：培养温度(25±1)℃，光照1500lx，光照时间为16h/d，诱导培养周期为20d。诱导培养20d后，如图1所示，其中横线为bar，bar＝1cm。经检测，葛根试管薯诱导率为95.6％。

对比例

对比例除与实施例1的生根培养和诱导培养不同外，其余条件均相同，即将所获得的葛根组培苗直接转入试管薯诱导培养基ms+6-ba2mg/l+naa0.02mg/l+ja1μmol/l+蔗糖80g/l+琼脂粉6g/l培养基中，25天后葛根试管薯的诱导率为25.1％。

实施例2

选取生长健壮、无病虫害植株的幼嫩茎蔓，剪掉其叶片后放入加有洗洁精的水中浸泡20min，用软毛刷清洗表面污垢，在流水中冲洗20min。

在超净工作台上，用0.1％hgcl2浸泡处理6min，再用无菌水冲洗4次，用无菌滤纸吸干外植体表面水分。

在无菌条件下，将茎段切成1cm长带一个腋芽的茎段，将生物学下端垂直竖插于初代培养基ms+0.1mg/l6-ba+0.05mg/lnaa+30.0g/l蔗糖+6.0g/l琼脂(ph，5.8)中进行培养。培养条件：培养温度(25±1)℃，光照强度1500lx，光照时间为16h/d。

培养5周后，将初代培养的无菌苗单芽茎段转入继代增殖培养基ms+0.01mg/l6-ba+0.05mg/lnaa+30.0g/l蔗糖+6.0g/l琼脂(ph，5.8)。培养条件：培养温度(25±1)℃，光照强度1500lx，光照时间为16h/d。每28天为一个循环继代周期，即获得葛根组培苗。

将无菌葛根组培苗转接到生根培养基1/2ms+naa0.02mg/l+蔗糖30g/l+琼脂粉6g/l的半固体培养基中进行生根培养5d，培养条件为暗培养，培养温度(25±1)℃。待根长为1.0cm时，转入试管薯诱导培养基ms+6-ba2mg/l+naa0.02mg/l+ja5μmol/l+蔗糖80g/l+琼脂粉6g/l，培养条件为光培养，培养温度(25±1)℃，光照1800lx，光照时间为16h/d，诱导培养周期为22d。经检测，葛根试管薯诱导率为98.4％。

对比例

对比例除与实施例2的生根培养和诱导培养不同外，其余条件均相同，即将所获得的葛根组培苗直接转入试管薯诱导培养基ms+6-ba2mg/l+naa0.02mg/l+ja1μmol/l+蔗糖80g/l+琼脂粉6g/l培养基中，25天后统计葛根试管薯的诱导率为24.0％。

实施例3

选取生长健壮、无病虫害植株的幼嫩茎蔓，剪掉其叶片后放入加有洗洁精的水中浸泡18min，，用软毛刷清洗表面污垢，在流水中冲洗25min。

在超净工作台上，用0.1％hgcl2浸泡处理10min，再用无菌水冲洗5次，用无菌滤纸吸干外植体表面水分。

在无菌条件下，将茎段切成1.5cm长带一个腋芽的茎段，将生物学下端垂直竖插于初代培养基ms+0.3mg/l6-ba+0.05mg/lnaa+30.0g/l蔗糖+6.0g/l琼脂(ph，5.8)中进行培养。培养条件：培养温度(25±1)℃，光照强度1500lx，光照时间为16h/d。

培养4周后，将初代培养的无菌苗单芽茎段转入继代增殖培养基ms+0.05mg/l6-ba+0.05mg/lnaa+30.0g/l蔗糖+6.0g/l琼脂(ph，5.8)。培养条件：培养温度(25±1)℃，光照强度1500lx，光照时间为16h/d。每30天为一个循环继代周期，即获得葛根组培苗。

将无菌葛根组培苗转接到生根培养基1/2ms+naa0.02mg/l+蔗糖30g/l+琼脂粉6g/l的半固体培养基中进行生根培养5d，培养条件为暗培养，培养温度(25±1)℃。待根长为0.8cm时，转入试管薯诱导培养基ms+6-ba2mg/l+naa0.02mg/l+ja10μmol/l+蔗糖80g/l+琼脂粉6g/l，培养条件为光培养，培养温度(25±1)℃，光照2000lx，光照时间为16h/d，诱导培养周期为25d。经检测，葛根试管薯诱导率为95.1％。

对比例

对比例除与实施例3的生根培养和诱导培养不同外，其余条件均相同，即将所获得的葛根组培苗直接转入试管薯诱导培养基ms+6-ba2mg/l+naa0.02mg/l+ja1μmol/l+蔗糖80g/l+琼脂粉6g/l培养基中，25天后统计葛根试管薯的诱导率为24.8％。

对照例

对照组采用常规种植葛根的方法，即3月下旬至4月上旬，将培育好的葛根苗移栽到种植穴中，种植穴间距为1.0～1.2米，移栽后将土壤压紧、压实，浇足定根水。在田间培养120～130d后，才可以形成块根。

本发明提供了一种葛根试管薯离体诱导方法，可明显提高试管薯诱导率，缩短试管薯诱导时间，在20～25d的诱导时间内，试管薯诱导效率可高达95％以上。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。