本发明涉及水产生物
技术领域：
，尤其是涉及一种诱导太平洋真宽水蚤产休眠卵的方法。技术背景桡足类，隶属于节肢动物门、甲壳纲、桡足亚纲，是浮游动物的重要组成部分，为小型甲壳动物，体长<3mm，营浮游与寄生生活，分布于海洋、淡水或半咸水中。因其是大多数鱼类幼体的开口饵料之一，故在水生态系统食物网和水产养殖中具有重要意义。太平洋真宽水蚤隶属于哲水蚤目、宽水蚤科、真宽水蚤属，是低盐区十分常见的暖水性沿岸桡足类物种之一。太平洋真宽水蚤主要出现在夏秋季，到秋末开始产休眠卵，休眠卵沉入海底被埋入海泥并间续孵化以补充种群。桡足类是水域生态系统的关键类群，在物质循环、能量流动和信息传递中起着重要作用。休眠卵是桡足类的重要生存策略，在抵抗不利环境、维持种群延续等方面起着重要作用，对桡足类种群的季节动态和物种延续具有十分重要的意义。休眠卵是桡足类在不良环境条件下进行有性生殖延续后代的产物，休眠卵具有抵抗外界不良环境、易于扩散和通过重组产生遗传多样性等特点，也是浮游动物集约化培养的重要种源，通过桡足类快速的孤雌生殖在短时间内大量繁殖，使得桡足类作为鲜活饵料为水产经济动物的苗种生产起到极其重要的作用。休眠卵的产生、诱导休眠卵的形成以及休眠卵的适时孵化利用也是水产养殖业中非常有意义的课题。桡足类因其体内富含某些必需脂肪酸，特别是epa和dha，在水产育苗上有很多应用，常常被用来作为一些经济鱼类的开口饵料。随着研究的深入和科学技术的发展，通过桡足类休眠卵获得大量无节幼体逐渐被人们重视和利用，休眠卵的规模培养将在现代海水养殖中发挥重要作用，具有广阔的应用前景。然而研究休眠卵的结构等课题则受限于一年之内只有一个季节才能在海区采集休眠卵，且研究发现太平洋真宽水蚤生产休眠卵的节律性，主要是其母代所经历的外界环境刺激，如温度、光照周期和环境盐度等外界因子，或其动物行为如性选择、寄生行为、产卵行为等，对子代表现型差异性的影响，因此如何诱导生产大量休眠卵是一个亟待解决的难题。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种可操作性强，可重复性高，休眠卵发生率高，诱导效率高的诱导太平洋真宽水蚤产休眠卵的方法，该方法充分利用光照、温度、盐度联合刺激的措施来完成高效率诱导，利用递进下降式温度-光照刺激法，获得更多、能量存储更充足的真宽水蚤休眠卵。本发明针对
背景技术：
：中提到的问题，采取的技术方案为：一种诱导太平洋真宽水蚤产休眠卵的方法，是通过对真宽水蚤成体进行递进下降式光照、温度与盐度联合刺激，获得并收集休眠卵。该方法简单便捷，充分利用光照、温度与盐度联合刺激的措施来完成高效率诱导，利用递进下降式温度-光照刺激法能够刺激真宽水蚤母代有性生殖，获得更高的休眠卵发生率，实现快速高效地诱导生产休眠卵的目的。作为优选，递进下降式光照、温度与盐度联合刺激的具体步骤为：步骤1：调节培养液盐度为2.8～3.1％，在温度为24～27℃、光照强度为2500～3000lux、明暗时间为16h:8h的条件下，暂养3～5d；步骤2：将培养液盐度调为3.3～3.6％，在温度为18～22℃，光照强度为1800～2000lux，明暗时间为12h:12h的条件下，养殖23～26h；步骤3：将培养液盐度调为3.3～3.6％，在温度为15～18℃，光照强度为1800～2000lux，明暗时间为12h:12h的条件下，养殖23～26h；步骤4：将培养液盐度调为3.3～3.6％，在温度为12～16℃，光照强度为1800～2000lux，明暗时间为12h:12h的条件下，培养至休眠卵产生。光照、温度、水环境盐度、湿度、食物等非生物因素对浮游动物的生殖及休眠卵的生产均有一定的诱导作用，比如在较高的温度下，真宽水蚤成体会加速发育，缩短性成熟所需的时间，加快和促进了真宽水蚤的生长和生殖，而较低的温度能够诱发桡足类的两性生殖；而其他非生物因素也都对真宽水蚤的生殖量和休眠卵发生率有明显的影响。作为优选，真宽水蚤成体在培养液中的种群密度为0.06～1.6个/ml。种群密度是动物自我调节以保持种群稳定的一个重要因素，随着种群密度增加，真宽水蚤之间碰撞率增大，产生休眠卵的几率显著增多，而适量控制种群密度，能避免种群密度过大时，会引起的食物不足和空间拥挤，进而避免减少其生殖量。作为优选，休眠卵的收集是使用孔径为45～50μm的筛绢进行收集。作为优选，诱导太平洋真宽水蚤产休眠卵所用的培养液中包含由脱落酸和乙酰胆碱组成的助诱剂。脱落酸与乙酰胆碱在接受光照刺激后，形成高度活跃状态，其分子中含有的α与β不饱和酮结构，容易与蛋白质中氨基酸的氢原子结合，进而与卵母细胞膜上的滞育激素受体结合，提高了卵母细胞膜上海藻糖酶的活性，从而将母体血液中的海藻糖分解成葡萄糖，葡萄糖通过细胞膜进入卵母细胞，在卵母细胞中合成大量的糖原并贮备下来，使得产下的受精卵在胚胎真皮分化完成前的胚胎初期进入休眠状态，致使休眠卵的发生率得到进一步提升的同时，能够为休眠卵存储更充足的能量。进一步优选，最优的技术方案为，助诱剂中脱落酸和乙酰胆碱的重量比为2～2.5:1.5。进一步优选，诱导太平洋真宽水蚤产休眠卵所用的培养液中还包含亚心形扁藻和中肋骨条藻的培养液，其制备步骤为：将亚心形扁藻和中肋骨条藻接种于ms液体培养基上，调节培养基ph为7.5～8.5，盐度为15～35‰，在温度20～30、℃光照强度5000～10000lux的条件下，培养即得。单胞藻不仅大小合适能被浮游动物摄食，更重要的能在动物体内被快速消化吸收，并含有丰富的营养，有助于动物的生长发育，由于种类繁多和其浮游特性成为浮游动物的觅食对象，经过营养搭配之后便是理想的浮游动物饵料。进一步优选，诱导太平洋真宽水蚤产休眠卵所用的培养液包含以下重量份原料：5～10份亚心形扁藻和中肋骨条藻培养液、20～25份灭菌海水、0.25～0.55份助诱剂。再进一步优选，灭菌海水是取天然海水用孔径为35～45μm的筛绢滤去浮沙和杂物后，灭菌并连续充气20～25h即得。与现有技术相比，本发明的优点在于：1)本发明中提供的诱导太平洋真宽水蚤产休眠卵的方法有效解决了太平洋真宽水蚤休眠卵的采集问题，可以不受限于野外海区的采集和生物产卵的节律性，能够获得更多、能量存储更充足的休眠卵；2)本发明中在诱导太平洋真宽水蚤产休眠卵的过程中，利用光照、温度与盐度联合刺激的措施来完成高效率诱导，利用递进下降式温度-光照刺激法来刺激真宽水蚤母代的有性生殖，获得了更高的休眠卵发生率，实现了快速高效地诱导生产休眠卵的目的；3)本发明中提供的诱导太平洋真宽水蚤产休眠卵的方法简单便捷，可操作性强，具有可重复性，休眠卵发生率高，且诱导效率高，能获得较高比例的休眠卵。具体实施方式下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：实施例1：一种诱导太平洋真宽水蚤产休眠卵的方法，是通过对经2个世代驯化培养、活力好的真宽水蚤成体进行递进下降式光照、温度与盐度联合刺激，获得并收集休眠卵。该方法简单便捷，可操作性强，充分利用光照、温度与盐度联合刺激的措施来完成高效率诱导，利用递进下降式温度-光照刺激法能够刺激真宽水蚤母代有性生殖，获得更高的休眠卵发生率，实现快速高效地诱导生产休眠卵的目的。递进下降式光照、温度与盐度联合刺激的具体步骤为：步骤1：调节培养液盐度为2.8％，在温度为24℃、光照强度为2500lux、明暗时间为16h:8h的条件下，暂养3d；步骤2：将培养液盐度调为3.3％，在温度为18℃，光照强度为1800lux，明暗时间为12h:12h的条件下，养殖23h；步骤3：将培养液盐度调为3.3％，在温度为15℃，光照强度为1800lux，明暗时间为12h:12h的条件下，养殖23h；步骤4：将培养液盐度调为3.3％，在温度为12℃，光照强度为1800lux，明暗时间为12h:12h的条件下，培养至休眠卵产生。光照、温度、水环境盐度、湿度、食物等非生物因素对浮游动物的生殖及休眠卵的生产均有一定的诱导作用，比如在较高的温度下，真宽水蚤成体会加速发育，缩短性成熟所需的时间，加快和促进了真宽水蚤的生长和生殖，而较低的温度能够诱发桡足类的两性生殖；而其他非生物因素也都对真宽水蚤的生殖量和休眠卵发生率有明显的影响。真宽水蚤成体在培养液中的种群密度为0.06个/ml。种群密度是动物自我调节以保持种群稳定的一个重要因素，随着种群密度增加，真宽水蚤之间碰撞率增大，产生休眠卵的几率显著增多，而适量控制种群密度，能避免种群密度过大时，会引起的食物不足和空间拥挤，进而避免减少其生殖量。休眠卵的收集是使用孔径为45μm的筛绢进行收集。诱导太平洋真宽水蚤产休眠卵所用的培养液中包含由脱落酸和乙酰胆碱组成的助诱剂，助诱剂中脱落酸和乙酰胆碱的重量比为2:1.5，脱落酸与乙酰胆碱在接受光照刺激后，形成高度活跃状态，其分子中含有的α与β不饱和酮结构，容易与蛋白质中氨基酸的氢原子结合，进而与卵母细胞膜上的滞育激素受体结合，提高了卵母细胞膜上海藻糖酶的活性，从而将母体血液中的海藻糖分解成葡萄糖，葡萄糖通过细胞膜进入卵母细胞，在卵母细胞中合成大量的糖原并贮备下来，使得产下的受精卵在胚胎真皮分化完成前的胚胎初期进入休眠状态，致使休眠卵的发生率得到进一步提升的同时，能够为休眠卵存储更充足的能量。诱导太平洋真宽水蚤产休眠卵所用的培养液中还包含亚心形扁藻和中肋骨条藻的培养液，其制备步骤为：将亚心形扁藻和中肋骨条藻接种于ms液体培养基上，调节培养基ph为7.5，盐度为15‰，在温度20℃、光照强度5000lux的条件下，培养即得。单胞藻不仅大小合适能被浮游动物摄食，更重要的能在动物体内被快速消化吸收，并含有丰富的营养，有助于动物的生长发育，由于种类繁多和其浮游特性成为浮游动物的觅食对象，经过营养搭配之后便是理想的浮游动物饵料。诱导太平洋真宽水蚤产休眠卵所用的培养液包含以下重量份原料：5份亚心形扁藻和中肋骨条藻培养液、20份灭菌海水、0.25份助诱剂。灭菌海水是取天然海水用孔径为35μm的筛绢滤去浮沙和杂物后，灭菌并连续充气20h即得。实施例2：一种诱导太平洋真宽水蚤产休眠卵的方法，其中诱导太平洋真宽水蚤产休眠卵的步骤为：将经2个世代驯化培养、活力好的真宽水蚤成体置于培养液中，使真宽水蚤成体在培养液中的种群密度为0.26个/ml，在培养期间通过递进下降式光照、温度与盐度联合刺激的措施，获得并使用孔径为50μm的筛绢收集休眠卵。递进下降式光照、温度与盐度联合刺激的具体步骤为：步骤1：调节培养液盐度为3.0％，在温度为27℃、光照强度为3000lux、明暗时间为16h:8h的条件下，暂养4d；步骤2：将培养液盐度调为3.6％，在温度为20℃，光照强度为1900lux，明暗时间为12h:12h的条件下，养殖25h；步骤3：将培养液盐度调为3.6％，在温度为16℃，光照强度为1900lux，明暗时间为12h:12h的条件下，养殖25h；步骤4：将培养液盐度调为3.6％，在温度为14℃，光照强度为1900lux，明暗时间为12h:12h的条件下，培养至休眠卵产生。诱导太平洋真宽水蚤产休眠卵所用的培养液包含以下重量份原料：8份亚心形扁藻和中肋骨条藻培养液、25份灭菌海水、0.50份助诱剂，上述助诱剂中脱落酸和乙酰胆碱的重量比为2.5:1.5。亚心形扁藻和中肋骨条藻的培养液制备步骤为：将亚心形扁藻和中肋骨条藻接种于ms液体培养基上，调节培养基ph为8.5，盐度为30‰，在温度25℃、光照强度10000lux的条件下，培养即得。灭菌海水是取天然海水用孔径为40μm的筛绢滤去浮沙和杂物后，灭菌并连续充气22h即得。实施例3：一种诱导太平洋真宽水蚤产休眠卵的方法，其中诱导太平洋真宽水蚤产休眠卵的步骤为：将经2个世代驯化培养、活力好的真宽水蚤成体置于培养液中，使真宽水蚤成体在培养液中的种群密度为0.8个/ml，在培养期间通过递进下降式光照、温度与盐度联合刺激的措施，获得并使用孔径为48μm的筛绢收集休眠卵。递进下降式光照、温度与盐度联合刺激的具体步骤为：步骤1：调节培养液盐度为3.0％，在温度为25℃、光照强度为2600lux、明暗时间为16h:8h的条件下，暂养3d；步骤2：将培养液盐度调为3.5％，在温度为22℃，光照强度为2000lux，明暗时间为12h:12h的条件下，养殖24h；步骤3：将培养液盐度调为3.5％，在温度为18℃，光照强度为2000lux，明暗时间为12h:12h的条件下，养殖24h；步骤4：将培养液盐度调为3.5％，在温度为16℃，光照强度为2000lux，明暗时间为12h:12h的条件下，培养至休眠卵产生。诱导太平洋真宽水蚤产休眠卵所用的培养液包含以下重量份原料：10份亚心形扁藻和中肋骨条藻培养液、22份灭菌海水、0.35份助诱剂，上述助诱剂中脱落酸和乙酰胆碱的重量比为2.3:1.5。亚心形扁藻和中肋骨条藻的培养液制备步骤为：将亚心形扁藻和中肋骨条藻接种于ms液体培养基上，调节培养基ph为8.0，盐度为25‰，在温度28℃、光照强度8000lux的条件下，培养即得。灭菌海水是取天然海水用孔径为45μm的筛绢滤去浮沙和杂物后，灭菌并连续充气24h即得。实施例4：一种诱导太平洋真宽水蚤产休眠卵的方法，进一步优化方案为：诱导太平洋真宽水蚤产休眠卵用培养液在步骤4中调节盐度时，向培养液中添加重量占比为0.065％的谷氨酰胺，谷氨酰胺中l-谷氨酰胺和d-谷氨酰胺的重量比为5:0.8，此时培养液中的微藻经真宽水蚤长时间的采食，处于微藻含量较低的水平，真宽水蚤在较短的时间内会处于饥饿状态，导致真宽水蚤肠粘膜通透性增加，将该配比的谷氨酰胺加入培养液中，可以刺激肠道保持粘膜结构，增强肠道细胞活性，促使胰岛素和睾酮分泌增加，促进成体的有性生殖，同时能与防冻蛋白和视蛋白形成偶联，在关照周期内刺激母体快速达到滞育诱导敏感期，释放出更多滞育激素，将母代接收的外界不良刺激信号转化成滞育信号，直接作用于子代，从而使得诱导效率提高，并刺激了母代产生更多、更稳定的休眠卵。诱导太平洋真宽水蚤产休眠卵的步骤为：将经2个世代驯化培养、活力好的真宽水蚤成体置于培养液中，使真宽水蚤成体在培养液中的种群密度为0.8个/ml，在培养期间通过递进下降式光照、温度与盐度联合刺激的措施，获得并使用孔径为48μm的筛绢收集休眠卵。递进下降式光照、温度与盐度联合刺激的具体步骤为：步骤1：调节培养液盐度为3.0％，在温度为25℃、光照强度为2600lux、明暗时间为16h:8h的条件下，暂养3d；步骤2：将培养液盐度调为3.5％，在温度为22℃，光照强度为2000lux，明暗时间为12h:12h的条件下，养殖24h；步骤3：将培养液盐度调为3.5％，在温度为18℃，光照强度为2000lux，明暗时间为12h:12h的条件下，养殖24h；步骤4：将培养液盐度调为3.5％，在温度为16℃，光照强度为2000lux，明暗时间为12h:12h的条件下，培养至休眠卵产生。诱导太平洋真宽水蚤产休眠卵所用的培养液包含以下重量份原料：10份亚心形扁藻和中肋骨条藻培养液、22份灭菌海水、0.35份助诱剂，上述助诱剂中脱落酸和乙酰胆碱的重量比为2.3:1.5。亚心形扁藻和中肋骨条藻的培养液制备步骤为：将亚心形扁藻和中肋骨条藻接种于ms液体培养基上，调节培养基ph为8.0，盐度为25‰，在温度28℃、光照强度8000lux的条件下，培养即得。灭菌海水是取天然海水用孔径为45μm的筛绢滤去浮沙和杂物后，灭菌并连续充气24h即得。对比例：一种诱导太平洋真宽水蚤产休眠卵的方法，其中诱导太平洋真宽水蚤产休眠卵的步骤为：将经2个世代驯化培养、活力好的真宽水蚤成体置于培养液中，使真宽水蚤成体在培养液中的种群密度为0.8个/ml，在培养期间通过递进下降式光照、温度与盐度联合刺激的措施，获得并使用孔径为48μm的筛绢收集休眠卵。递进下降式光照、温度与盐度联合刺激的具体步骤为：步骤1：调节培养液盐度为3.0％，在温度为25℃、光照强度为2600lux、明暗时间为16h:8h的条件下，暂养3d；步骤2：将培养液盐度调为3.5％，在温度为22℃，光照强度为2000lux，明暗时间为12h:12h的条件下，养殖24h；步骤3：将培养液盐度调为3.5％，在温度为18℃，光照强度为2000lux，明暗时间为12h:12h的条件下，养殖24h；步骤4：将培养液盐度调为3.5％，在温度为16℃，光照强度为2000lux，明暗时间为12h:12h的条件下，培养至休眠卵产生。诱导太平洋真宽水蚤产休眠卵所用的培养液包含以下重量份原料：10份亚心形扁藻和中肋骨条藻培养液、22份灭菌海水。此对比例中，诱导太平洋真宽水蚤产休眠卵所用的培养液中未添加助诱剂，其他与实施例3一样，制得真宽水蚤休眠卵。实施例5：太平洋真宽水蚤休眠卵诱导生产试验选取经2个世代驯化培养、活力好的真宽水蚤成体，分别按照实施例1～4与对比例的条件放置在5个培育池中，同时设置一组空白组，采取普通光照、盐度和温度条件进行培育。在培育期间，严格控制各试验条件，当检测到繁殖母体数小于2个时，试验结束。实验结果统计如下。表1太平洋真宽水蚤休眠卵诱导生产试验雄体出现率/％休眠卵发生率/％正常卵发生率/％实施例140.764.535.5实施例240.664.735.3实施例342.765.334.7实施例443.365.534.5对比例37.857.342.7空白组33.350.549.5由上表可得，实施例1～4所得真宽水蚤的雄体出现率明显高于对比例，尤其是实施例3和4所得高于对比例13.7％，也显著高于空白组29.1％；实施例1～4的休眠卵发生率差异不大，平均高于对比例7.7％，高于空白组15％；有实验结果可得，本发明实施例中所生产的休眠卵发生率明显受到递进下降式光照、温度与盐度的联合刺激，休眠卵发生率明显提高，尤其是实施例3和4，同时也受到助诱剂的显著影响，说明本发明中利用光照、温度与盐度联合刺激的措施能完成对真宽水蚤休眠卵的诱导，同时能获得更高的休眠卵发生率，得到更多、能量存储更充足的休眠卵，实现快速高效地诱导生产休眠卵的目的。本发明操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12