菊薯粗糖在促进水稻根系生长和提高根系耐低温胁迫能力中的应用的制作方法

本发明涉及生物农药技术领域，尤其涉及菊薯粗糖在促进水稻根系生长和提高根系耐低温胁迫能力中的应用。

背景技术：

植物免疫诱抗剂又称植物疫苗，能够激活植物体内分子免疫系统，使植物自身产生抗菌物质，提高植物抗病性，同时还能激发植物体内的一系列代谢调控系统，具有促进植物生长和增加作物产量的作用。植物天然免疫具有预防性、系统性、稳定性、相对性、安全性等一系列优点，可以解决化学防治存在的病原菌抗药性、环境污染和对人畜副作用的问题，实现农产品无害化生产和农业可持续发展。

目前，诱抗剂可分为非生物来源和生物来源两大类。非生物来源的诱抗剂包括无机盐、有机酸、寡糖类、寡核苷酸、小分子多肽和免疫蛋白等。生物来源的诱抗剂除源自植物的寡聚半乳糖和源自细菌的过敏素(harpin)外，还包括病毒衣壳蛋白、糖蛋白类等诱抗剂。

有些生物源激发子是无毒基因的产物，是专化性的，但大部分激发子是非专化性的。病原微生物作为激发子可以是活体菌、菌体培养滤液、菌体匀浆或菌体细胞提取液等，主要是非致病性或弱致病性病菌。研究发现可可丛枝病原菌crinipellisperniciosa菌丝体的水溶液可激活番茄对疮痂病的抗性，诱导体内过氧化物酶、多酚氧化酶、几丁质酶的积累和木质素的沉积。黄青霉penicilliumchrysogenum的提取物可以作为诱导因子，诱导拟南芥对霜霉病、灰霉病、黑斑病和细菌性斑点病的抗性。木霉菌可直接与植物相互作用，能够诱导植物产生对病原菌的抗性。大蒜、洋葱、花椒、大黄等植物源提取物作为激发子可以诱导马铃薯抗晚疫病。前胡、白芷的水提取液可诱导水稻对稻瘟病的抗性及小麦对赤霉病的抗性。青蒿、独活可诱导西瓜抗花叶病。

果寡糖又名低聚果糖，是在蔗糖分子基础上以糖苷键的形式结合数个d-果糖所形成的一类低聚糖的总称，具有低热、稳定、安全无毒的良理化性能，大部分不能被动物本身的消化酶所消化，但到达肠道后可作为有益微生物的底物，而不能被病原微生物利用，从而促进有益微生物的繁殖和抑制有害微生物。果寡糖还能促进人体内b族维生素合成，提高机体新陈代谢水平，增强免疫力和抗病力，同时促进钙、镁、铁等矿物质吸收。

天然植物中存在的果寡糖主要是由植物中的果糖转移酶通过催化反应生成，其中富含果寡糖的植物主要有菊薯、菊芋、冬小麦和洋葱等。其中，菊薯粗糖经水浸提法方法检测得知，菊薯粗糖主要是由蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖组成，其中果寡糖占其干物质的45％-65％。目前，研究者们对于菊薯粗糖的研究较少，其有何功能也尚未可知，因此，有必要对菊薯粗糖的功能做进一步地深入探究。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供菊薯粗糖在促进水稻根系生长以及提高水稻根系耐低温胁迫能力的新用途，为新型免疫诱抗剂的生产奠定理论基础。

具体内容如下：

本发明提供了菊薯粗糖在促进水稻根系生长中的应用。

进一步地，所述菊薯粗糖促进水稻主根的生长和根系的活力。

本发明通过浸种和琼脂培养基种子萌发及幼苗生长试验证明，菊薯粗糖能够在水稻根系(水稻种子萌发时)有效促进主根的生长，以及提高主根的根系活力。

本发明还提供了菊薯粗糖在提高水稻根系耐低温胁迫能力中的应用。

进一步地，所述低温为1～10℃。

进一步地，所述菊薯粗糖通过降低水稻主根褐化率来提高水稻耐低温胁迫能力。

本发明还提供了一种植物免疫诱抗剂，其有效成分为菊薯粗糖。该植物免疫诱抗剂既可以只包含菊薯粗糖这一种有效成分；也可以添加助剂如表面活性剂吐温80等。

进一步地，植物免疫诱抗剂中，菊薯粗糖的浓度为75～100ppm。

本发明还提供了一种水稻幼苗的培养方法，该方法包括：将水稻种子放入含有菊薯粗糖的水溶液中进行浸渍，取出后，清洗干净，再进行种子催芽，得到水稻幼苗。

其中，所述水稻免疫诱抗剂中，所述菊薯粗糖的浓度为75～100ppm；所述浸渍的时间为20～30h，温度为25～30℃。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明通过主根长、主根褐化率和根系活力等指标有效证明了菊薯粗糖在促进水稻根系生长以及提高水稻根系耐低温胁迫能力的新用途，为新型免疫诱抗剂的生产奠定理论基础。

附图说明

图1为不同浓度的菊薯粗糖处理水稻幼苗的主根生长情况。

图2为冷处理下水稻主根褐化表型的比较情况；

其中，a为清水浸种；b为75ppm浓度的菊薯粗糖浸种。

图3为冷处理下水稻主根褐化率的比较。

图4为不同处理下水稻根系活力的比较。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。

实施例1

一、试验材料

杂交水稻品种“中浙优一号”，由浙江勿忘农种业有限公司提供。

菊薯粗糖：采用水浸提法提取菊薯粗糖，具体步骤如下：

1.将菊薯洗净，切成小块，称取10克菊薯块放入烧杯中；

2.加入100ml超纯水，放入50℃水浴锅中，热水浴2小时，期间不断搅拌至菊薯变软；

3.待菊薯软化沉入杯底后，用移液枪吸取多次上清移入四个50ml离心管中并配平；

4.12000rpm离心20分钟；

5.用移液枪将上清移入新的50ml管子中，以糖溶液：100％酒精＝1:5的比例配制溶液；

6.将配制号的混合液放入4℃的冰箱中沉淀过夜；

7.12000rpm离心20分钟；

8.去上清，放入50℃烘箱中烘干，底部沉淀为菊薯粗糖；

9.刮取多糖并称重，存放在-20℃冰箱中备用。

二、不同浓度的菊薯粗糖处理

具体方法如下：

1.配制2％琼脂溶液，放在电磁炉上煮沸10分钟至无明显固体颗粒；

2.将之前制备好的菊薯粗糖固体配制成10000ppm(mg/l)的糖溶液；

3.准备12瓶水稻培养瓶，分别为对照、50ppm、75ppm、100ppm糖浓度，其中每个三个重复，每瓶倒入50ml琼脂溶液，待温度降低到不烫手时，加入10000ppm菊薯粗糖溶液，配制成不同浓度含有糖溶液的水稻琼脂培养基；

4.称取10g中浙优一号水稻种子，在水稻培养盒中倒入200ml超纯水，放入30℃水稻培养箱浸种一天；

5.倒掉上层水以及上浮的不合格种子，清洗种子两遍，将纱布润湿，铺在种子表面，放入30℃培养箱中催芽一天；

6.挑选已经露白的水稻种子，用镊子将种子插入琼脂培养基中，每个培养瓶插入15粒种子，注意将露白一面朝上，注意不要将已经长出的芽头弄断，不要插入太深，埋入琼脂1/2即可；

7.用薄膜包住瓶口以防止水分蒸发致使琼脂干瘪，放入培养室中培养，培养条件为27℃，湿度70％，光照时间18小时，培养10天测量指标，当水稻长到快顶到瓶口时，掀开薄膜，向每瓶中加入等量的纯水。

结果：从图1中可以看出，75ppm和100ppm菊薯粗糖处理的水稻主根长均显著高于对照，而50ppm菊薯粗糖处理的水稻主根长与对照相比无显著差异。这说明：75ppm和100ppm菊薯粗糖对水稻主根具有显著的促生长作用。

三、水稻种子的冷处理

具体方法如下：

(1)称取6份中浙优一号水稻种子，每份10g，每份分别加入至100ml清水或100ml75mg/l菊薯粗糖溶液中浸种，重复2次。

(2)30℃浸种24h后，弃去溶液，然后用纯水清洗三遍，以洗去多余的糖溶液。

(3)将水稻种子置于用水润湿滤纸的发芽盒中，上面盖一层用纯水浸润的滤纸，然后放入30℃培养箱中催芽45h。

(4)挑选根长约1cm和芽长0.5cm左右长势正常的水稻幼苗平铺在湿润滤纸的发芽盒中，每行可以摆放8粒幼苗，共6排一共为48粒。

按照上述方法摆放6盒清水浸种幼苗，6盒菊薯粗糖浸种幼苗。其中每个实验组三盒幼苗放入4℃冰箱处理48h，余下每个实验组的三盒幼苗放在25℃培养。

(5)48h后拿出冷处理(4℃)幼苗与正常培养(25℃)幼苗放在27℃培养室中培养，光照每天18h。

(6)实时观察幼苗表型，统计水稻幼苗根部褐化数目，当出现较为明显表型时，拍照保存。

结果：通过用75ppm菊薯粗糖浸种的水稻经过低温4℃处理后恢复5天的表型观察(图2)，结果发现清水浸种的水稻根部呈现出不同程度的褐化，统计水稻主根褐化率，菊薯粗糖浸种水稻根部褐化率极显著低于清水浸种水稻(图3)。

四、水稻根系活力测定方式

具体方法如下：

1.将表型明显的处理组和对照组的水稻幼苗(一般在冷处理完恢复3天后)主根剪下，每份称取0.5g，每个实验组三个重复，再剪成约0.5cm的小段。将剪碎的水稻根放入10ml离心管中，同时加入5ml新鲜配制的0.4％ttc溶液和5ml磷酸缓冲液等量混合成10ml保证所有根都浸没在混合溶液中。在37℃的恒温培养箱中暗处理2小时，以保证所有根充分染色(显红色)。

2.与此同时，制作ttc标准曲线，取0.4％ttc溶液0.4ml再加入19.6ml乙酸乙酯和适量的保险粉，它们所反应生成的红色溶液为ttf溶液作为制作标准曲线的母液。分别配制20、40、80、120、160、200微克的ttf溶液，其中配置20微克ttf反应液所需的母液与甲醇的体积分别0.5ml和19.5ml，用紫外分光光度计485nm波长测定6个梯度的od值，绘制标准曲线。

3.暗处理反应完成后，向每个管子中加入2ml的1mol/l的硫酸以中止反应。将根取出倒入包有滤纸的漏斗中，将溶液尽量滤干。向50ml离心管中加入10ml甲醇，将根加入甲醇中，37℃恒温培养箱中避光过夜脱色至根部变白为止。

4.用分光光度计测定485nm下od值，利用标准曲线获得相应od值下ttf的质量，根据公式a＝cm/nt其中a为根系活力，c为标准曲线上获得的ttf值，m为测定吸光值时的稀释倍数，n为质量，t为用ttc溶液染液的反应时间。作图并分析数据。

结果：从图4可以看出，在低温处理后恢复生长5d条件下菊薯粗糖浸种处理水稻幼苗根系活力显著高于清水浸种，而在正常生长情况下，菊薯粗糖浸种幼苗与清水浸种幼苗根系活力相近，说明菊薯粗糖在水稻冷处理时对水稻根部可能具有较好的保护作用。