镧作为作物减镉剂和镉转运蛋白基因表达抑制剂以及增产剂的应用的制作方法

本发明属于农业环境技术领域，尤其涉及镧作为作物减镉剂和镉转运蛋白基因表达抑制剂以及增产剂的应用。

背景技术：

随着社会生产生活水平的快速提高，工业“三废”、城市垃圾排放总量逐年上升，农药、化肥长期滥用，以及城市污泥的大量使用，使得部分地区农业土壤中的重金属污染日益剧增，严重威胁着生态环境安全、粮食安全、国民健康及经济社会的可持续发展。镉(cd)是最常见、毒性最强的重金属之一。其移动性强，易被作物吸收，可在生物体中大量富集，对人类健康威胁巨大，临床上常表现为骨质疏松、癌变、肝肾功能紊乱以及高血压等疾病。

国际食品法典委员会就主要粮食作物可食部分cd含量设定了安全阈值，如在小麦籽粒为0.2mg/kg、水稻籽粒为0.4mg/kg。然而，大部分生长在cd污染土壤的主要粮食作物可食部分cd的含量却超过了安全标准。针对这一现状，研发一套快速有效的综合防治技术，有效降低主要粮食作物如小麦籽粒中镉含量，对确保我国乃至世界粮食安全与生态环境安全，缓解当前人口与耕地资源矛盾有着重要的现实意义。

研究表明适宜浓度的稀土具有提高作物产量、改善作物品质以及增强作物对不良环境抗逆性的生物学效应，稀土在农业上的推广应用也取得了显著的社会效益和经济效益。镧(la)是稀土金属中最活泼的金属之一，能够有效调节植物根器官形成、促进种子萌发和提高植物光合作用，提高作物的抗逆性能和作物产量。其主要的应用方式为根施和叶面喷施两种。la³⁺(116pm)与cd²⁺(109pm)有相近的离子半径，且镧离子的电荷高于cd离子。由于离子势等于离子电荷与离子半径之比，所以镧离子的离子势大于cd离子，这可能使镧离子更容易被吸附到植物根系表面，通过竞争的方式阻止cd被植物吸收。另外，植物吸收cd主要通过质膜上特异性转运蛋白进入细胞。nramp5(naturalresistance-associatedmacrophageprotein)位于植物根质膜上，在水稻和大麦子中，nramp5基因沉默或敲除，其地上部和地下部cd含量均显著降低。hma4(heavymetalatpase4)位于植物根部中柱鞘细胞质膜上，将cd从细胞中泵出来，通过木质部的加载转运到地上部。hma4基因沉默或敲除能够有效的降低植物根部cd向地上部转运。la作为减镉剂减少作物对cd累积的同时，能有效促进作物增产。因此，应用镧将是解决目前农业cd污染土壤粮食安全隐患的有效方法之一。这也将为研发重金属污染土壤治理的新理念新技术提供参考。

技术实现要素：

为了减少作物对cd的吸收和转运，降低作物籽粒中cd的含量，本发明提供一种镧作为作物减镉剂和镉转运蛋白基因表达抑制剂以及增产剂的应用。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种降低作物籽粒中镉含量的方法，该作物为小麦，在小麦生长至拔节期时，向镉污染土壤中施加含镧离子的试剂；再在小麦生长至抽穗期时，进行叶面喷施含镧离子的试剂。

上述的一种降低作物籽粒中镉含量的方法，待小麦生长至拔节期时，对小麦进行根部施入镧，施入量为1.8-2.2mg/kg镧(按本实施例中1.13g/cm³土壤容重，每亩土壤质量约为15.1万公斤计算，即向土壤中施入镧272-332g/亩)。再在小麦生长至抽穗期时，对小麦进行叶面喷施镧，浓度为15-25mg/l，每亩喷施45-75l。

上述的一种降低作物籽粒中镉含量的方法，所述镧离子以硝酸镧的形式被施用。其中272-332g镧为硝酸镧中镧元素的量而非硝酸镧的量。

同时，该含镧离子的试剂还可以作为作物增产剂施用：

一种促进作物增产的方法，该作物为小麦，该方法为在小麦根部施用含镧离子的试剂；再在小麦生长至抽穗期时，进行叶面喷施含镧离子的试剂。

上述的一种促进作物增产的方法，待小麦生长至拔节期时，对小麦进行根部施入镧，施入量为1.8-2.2mg/kg镧(按本实施例中1.13g/cm³土壤容重、每亩土壤质量约为15.1万公斤计算，即向土壤中施入镧272-332g/亩)。再在小麦生长至抽穗期时，对小麦进行叶面喷施镧，浓度为15-25mg/l，每亩喷施45-75l。

上述的一种促进作物增产的方法，所述镧离子以硝酸镧的形式被施用。其中272-332g镧为硝酸镧中镧元素的量而非硝酸镧的量。

此外，该含镧离子的试剂还可以作为下调作物对cd吸收和转运有关转运蛋白基因表达的抑制剂：

一种下调作物对cd吸收和转运有关转运蛋白基因表达的抑制剂，该抑制剂中含有镧离子。该作物为小麦，在小麦生长至拔节期时，向镉污染土壤中施加含镧离子的试剂。

上述的一种下调作物对cd吸收和转运有关转运蛋白基因表达的抑制剂，所述镧离子来自于硝酸镧。

上述的一种下调作物对cd吸收和转运有关转运蛋白基因表达的抑制剂，该抑制剂的施用方式为根部施入，待小麦生长至拔节期时，对小麦进行根部施入镧，施入量为1.8-2.2mg/kg镧(按本实施例中1.13g/cm³土壤容重，每亩土壤质量约为15.1万公斤计算，即向土壤中施入镧272-332g/亩)。

进一步地，所述叶面镧的喷施方法为，先将硝酸镧溶于适量的水，制成镧水溶液，再用喷雾器在阴天喷洒镧水溶液于小麦叶面。以硝酸镧形式喷施叶面。

进一步地，所述根部施入镧的方法为，先将硝酸镧溶于适量的水，根据硝酸镧的施用量换算为相应体积的镧溶液施入土壤，以硝酸镧形式施入土壤。

本发明通过小麦全生育期盆栽试验，向土壤中施入镧以抑制小麦根部对cd的吸收和转运；并进一步通过叶面喷施镧的方式对cd进行阻控，使被小麦吸收的cd尽可能少地向小麦籽粒中转移，从而降低cd在小麦籽粒中的含量。

本发明的有益效果是：本发明的含镧离子的试剂，既能作为减镉剂，降低作物籽粒中镉的含量，又能作为增产剂，使作物增产，同时含镧离子的试剂还能作为作物对cd吸收和转运有关转运蛋白基因表达的抑制剂。

附图说明

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

图1为本发明镧对不同时间小麦根tanramp5基因相对表达的影响。

图2为本发明镧对不同时间小麦根tahma4基因相对表达的影响。

具体实施方式

下面申请人将结合具体的实施例对本发明方法进一步说明。应理解，以下实施例仅用于对本发明请求保护的技术方案作出清楚的说明，而不应被理解为对本发明请求保护范围的限制。下面结合附表和实施例对本发明进一步说明。

下述实施例中所用小麦种子均为尧麦16，为低cd蓄积小麦品种，种子由江西省农业科学院提供。

实施例1：根部施入镧

本实例提供了一种通过根部施入镧降低小麦籽粒中cd含量的方法。待小麦生长至拔节期时，在小麦生长的cd污染土壤中施入镧，la通过抑制小麦根部吸收和转运cd相关转运蛋白基因的表达，减少小麦根部对cd的吸收和转运，从而降低cd在小麦籽粒中的含量。

在武汉大学校园苗圃采集20cm耕作层土壤。土壤被带回实验室后，剔除可见的石块和凋落物，室内风干。该土壤cd的背景值为0.42mg/kg。以外源添加cd的形式制备cd污染土壤，用该cd污染土壤作为供试土壤供小麦栽培。选择尿素为氮肥、过磷酸钙为磷肥，硫酸钾为钾肥，氮磷钾的施用量分别为n的有效量为100mg/kg，p的有效量为80mg/kg，k的有效量为50mg/kg。每组试验3个重复。

具体实验步骤：

(1)试验土壤被带回实验室，自然风干，剔除可见石块和凋落物，研磨后，过2mm的筛子。在土壤中加入10mg/kgcd，完全混合后，熟化1个月。

(2)向(1)所得土壤中施加33.3％尿素，100％的过磷酸钙和100％的硫酸钾作为底肥。其余的尿素于分蘖期和拔节期分别施加33.3％。

(3)将(2)所得土壤7.5kg装入塑料钵(直径26.5cm,高17.6cm)，并于10月下旬将小麦种子播种于塑料钵土壤中。

(4)按照小麦栽培常规方法对(3)所得样品进行露天栽培，待小麦生长至拔节期时，向塑料钵土壤中添加2mg/kg镧。

(5)待小麦成熟后，收获小麦整体植株，植株样品用自来水清洗干净，并将其根、茎、叶、颖壳、籽粒分离，置于烘箱中，65℃烘干至恒重。

(6)将(5)所得干燥恒重样品放入植物粉粹机中粉碎，将粉末样品置于干净烧杯中，并向烧杯中加入适量混合消解液(硝酸与高氯酸体积比＝4：1)，静置过夜。

(7)将(6)所得样品置于电热板加热消解，定容后，用原子吸收光谱仪(tas-990)测定样品溶液中cd的含量。

本实施例中向塑料钵添加的镧可在一定范围内波动，具体为，待小麦生长至拔节期时，向塑料钵土壤中添加1.8-2.2mg/kg镧(按本实施例中1.13g/cm³土壤容重、每亩土壤质量约为15.1万公斤计算，即向土壤中施入镧272-332g/亩)。

实施例2：叶面喷施镧

本实施例提供了一种用叶面喷施镧降低小麦籽粒中cd含量的方法。待小麦生长至孕穗期，喷施叶面镧，通过阻控小麦地上部分cd向籽粒转运，以降低cd在小麦籽粒中的含量。

在武汉大学校园苗圃采集20cm耕作层土壤，土壤被带回实验室后，剔除可见的石块和凋落物，室内风干。该土壤cd的背景值为0.42mg/kg。以外源添加cd的形式制备cd污染土壤，用该cd污染土壤作为供试土壤供小麦栽培。选择尿素为氮肥、过磷酸钙为磷肥，氮磷钾的施用量分别为n的有效量为100mg/kg，p的有效量为80mg/kg，k的有效量为50mg/kg。每组试验3个重复。

具体实验步骤：

(1)试验土壤被带回实验室，自然风干，剔除大块石头和凋落物，研磨后，过2mm的筛子。在土壤中加入10mg/kgcd，完全混合后，熟化1个月。

(2)向(1)所得土壤中施加33.3％尿素，100％的过磷酸钙和100％的硫酸钾作为底肥。其余的尿素于分蘖期和拔节期分别施加33.3％。

(3)将(2)所得土壤7.5kg装入塑料钵(直径26.5cm,高17.6cm)，并于10月下旬将小麦种子播种于塑料钵土壤中。

(4)按照小麦栽培常规方法对(3)所得样品进行露天栽培，待小麦生长至孕穗期时，对小麦进行叶面喷施20mg/l镧，每钵约喷5ml。

(5)待小麦成熟后，收获小麦整体植株，植株样品用自来水清洗干净，并将其根、茎、叶、颖壳、籽粒分离，置于烘箱中，65℃烘干至恒重。

(6)将(5)所得干燥恒重样品放入植物粉粹机中粉碎，将粉末样品置于干净烧杯中，并向烧杯中加入适量混合消解液(硝酸与高氯酸体积比＝4：1)，静置过夜。

(7)将(6)所得样品置于电热板加热消解，定容后，用原子吸收光谱仪(tas-990)测定样品溶液中cd的含量。

本实施例中，在小麦生长至抽穗期时，对小麦进行叶面喷施镧，浓度和喷施量可在一定范围内浮动，具体为15-25mg/l，每亩喷施45-75l。

实施例3：根部施入镧和叶面喷施镧联合进行

本实施例提供了一种通过根部施加镧，并进一步联合叶面喷施镧的方式降低小麦籽粒中cd含量的方法。待小麦生长至拔节期时根部施入镧，镧通过抑制小麦根系吸收和转运cd相关转运蛋白基因的表达，减少小麦根部对cd的吸收和转运。再在小麦抽穗期叶面喷施镧，通过阻控小麦地上部分cd向籽粒转运，进一步减少小麦籽粒中cd的含量。

在武汉大学校园苗圃采集20cm耕作层土壤，土壤被带回实验室后，剔除可见的石块和凋落物，室内风干。该土壤cd的背景值为0.42mg/kg。以外源添加cd的形式制备cd污染土壤，用该cd污染土壤作为供试土壤供小麦栽培。选择尿素为氮肥、过磷酸钙为磷肥，硫酸钾为钾肥，氮磷钾的施用量分别为n的有效量为100mg/kg，p的有效量为80mg/kg，k的有效量为50mg/kg。每组试验3个重复。

具体实验步骤：

(1)试验土壤被带回实验室，自然风干，剔除可见石块及凋落物，研磨后，过2mm的筛子。在土壤中加入10mg/kgcd，完全混合后，熟化1个月。

(2)向(1)所得土壤中施入33.3％尿素，100％的过磷酸钙和100％的硫酸钾作为底肥。其余的尿素于分蘖期和拔节期分别施加33.3％。

(3)将(2)所得土壤7.5kg装入塑料钵(直径26.5cm,高17.6cm)，并于10月下旬将小麦种子播种于塑料钵土壤中。

(4)按照小麦栽培常规方法对(3)所得样品进行露天栽培，待小麦生长拔节期期时，向塑料钵土壤中施加2mg/kg镧。待小麦生长至孕穗期时，再对小麦进行叶面喷施20mg/l镧，每钵约喷5ml。

(5)待小麦成熟后，收获小麦整体植株，植株样品用自来水清洗干净，并将其根、茎、叶、颖壳、籽粒分离，置于烘箱中，65℃烘干至恒重。

(6)将(5)所得干燥恒重样品放入植物粉粹机中粉碎，将粉末样品置于干净烧杯中，并向烧杯中加入适量混合消解液(硝酸与高氯酸体积比＝4：1)，静置过夜。

(7)将(6)所得样品置于电热板加热消解，定容后，用原子吸收光谱仪(tas-990)测定样品溶液中cd的含量。

本实施例中向塑料钵添加的镧可在一定范围内波动，具体为，待小麦生长至拔节期时，向塑料钵土壤中添加1.8-2.2mg/kg镧(按本实施例中1.13g/cm³土壤容重、每亩土壤质量约为15.1万公斤计算，即向土壤中施入镧272-332g/亩)。在小麦生长至抽穗期时，对小麦进行叶面喷施镧，浓度和喷施量可在一定范围内浮动，具体为15-25mg/l，每亩喷施45-75l。

对比例1

在武汉大学校园苗圃采集20cm耕作层土壤，土壤被带回实验室后，剔除可见的石块和凋落物，室内风干。该土壤cd的背景值为0.42mg/kg。以外源添加cd的形式制备cd污染土壤，用该cd污染土壤作为供试土壤供小麦栽培。选择尿素为氮肥、过磷酸钙为磷肥，硫酸钾为钾肥，氮磷钾的施用量分别为n的有效量为100mg/kg，p的有效量为80mg/kg，k的有效量为50mg/kg。每组试验3个重复。

具体实验步骤：

(1)试验土壤被带回实验室，自然风干，剔除可见石块和凋落物，研磨后，过2mm的筛子。在土壤中加入10mg/kgcd，完全混合后，熟化1个月。

(2)向(1)所得土壤中施加33.3％尿素，100％的过磷酸钙和100％的硫酸钾作为底肥。其余的尿素于分蘖期和拔节期分别施加33.3％。

(3)将(2)所得土壤7.5kg装入塑料钵(直径26.5cm,高17.6cm)，并于10月下旬将小麦种子播种于塑料钵土壤中。

(4)按照小麦常规栽培方法对(3)所得样品进行露天栽培。

(5)待小麦成熟后，收获小麦整体植株，植株样品用自来水清洗干净，并将其根、茎、叶、颖壳、籽粒分离，置于烘箱中，65℃烘干至恒重。

(6)将(5)所得干燥恒重样品放入植物粉粹机中粉碎，将粉末样品置于干净烧杯中，并向烧杯中加入适量混合消解液(硝酸与高氯酸体积比＝4：1)，静置过夜。

(7)将(6)所得样品置于电热板加热消解，定容后，用原子吸收光谱仪(tas-990)测定样品溶液中cd的含量。

实施例1-3和对比例1试验结果：将上述实施例1-3和对比例1共四组实验进行数据汇集和比对，如表1所示。根据表1中结果可见，不同实施处理对小麦吸收和转运cd有明显差异。与对比例1比较，实施例1-3均降低了小麦根、茎、叶、颖壳、籽粒中cd含量。其中实施例3中小麦籽粒cd含量最低(仅为2.14±0.06mg/kg)，较对比例1降低了36.9％。其次，不同实施处理均增加了小麦产量，其中实施例3(7.72±0.47)较对比例1增加了10.4％。实验结果说明，通过实施例3的方案可以有效地降低小麦籽粒中cd的含量，同时增加产量。

表1镧不同施加方式对小麦不同部位cd含量及产量的影响

实施例4：水培法验证镧作为作物吸收和转运cd蛋白基因表达的抑制剂

本实施例通过水培试验，发现镧能有效地下调小麦吸收和转运cd有关转运蛋白基因的表达。具体试验步骤如下：

(1)挑选饱满一致的适量小麦种子，在5％次氯酸钠浸泡15min，后用去离子水冲洗干净。将洗干净的小麦种子均匀铺放到垫有滤纸的培养皿中，并在滤纸上加入适量去离子水保持种子湿润，放入黑暗的培养箱中萌发。保持温度25℃，湿度为80％的条件下预培养两天让种子萌发。

(2)将(1)萌发的种子转入干净的石英砂中，用1/2强度的霍格兰营养液培养。霍格兰营养液含：2mmmgso4·7h2o,5mmca(no3)2·4h2o,5mmkno3,1mmkh2po4,0.02mmfe-edta,0.045mmh3bo3,0.91μmmncl2,0.32μmcuso4·5h2o，0.76μmznso4·7h2o和0.038μmnamoo4·2h2o。用naoh或hcl调节ph值至6.0。植物在自然光、白天/夜间温度为26/20℃、湿度为70/85％，光合作用的光子通量为400μmolm^-2s^-1的条件下培养。

(3)待(2)培养的小麦长至两叶一心时，挑选长势一致的幼苗在1.5升含完全霍格兰营养液的塑料盆中预培养3天。

(4)将(3)所得小麦幼苗设置空白对照(ck)、1mg/l镧处理(la)、1mg/lcd处理(cd)、1mg/lcd+1mg/l镧处理(cd+la)。为了防止镧离子与磷酸根离子产生磷酸镧沉淀,小麦幼苗在去除kh2po4完全霍格兰营养液中处理，通过叶面喷施0.5mmkh2po4的方式补充小麦生长所需的p元素。分别处理12、24和72小时后收获小麦根样品。

(5)将(4)所得的根样品冻存在-80℃冰箱。

(6)根据trizol(invitrogen)试剂盒说明书，提取(5)所得样品rna，1％琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测rna质量和浓度。

(7)使用takara公司的primescriptreagentkit试剂盒对(6)所得样品进行反转录成为cdna。

(8)根据genebank登录号查找，tanramp5和tahma4以及内参β-tatubulin的基因序列，分别设计其荧光定量pcr的上下游引物。其序列号和引物如表2所示。

(9)将(7)所得样品进行荧光定量pcr。有关(8)的基因表达使用sybrpremixextaq(takara)染料，按照stepone^tmreal-timepcrsystem(appliedbiosystems,usa)的方式进行。

(10)用cfxmanager软件通过δδct的方法归一化基因的相对表达量。

表2荧光定量-pcr引物

试验结果如图1和2所示。结果表明，与对照组相比，cd处理上调了tanramp5和tahma4的基因表达。然而，当同时添加镧和镉处理后，tanramp5和tahma4基因的表达量均被下调。而且，单独添加镧处理后24h-72h，tanramp5和tahma4基因的表达量也被下调。这些结果说明镧是一种cd转运蛋白基因表达的抑制剂。

序列表

<110>武汉大学

<120>镧作为作物减镉剂和镉转运蛋白基因表达抑制剂以及增产剂的应用

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

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<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

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