本发明属于土壤改良技术领域，具体涉及一种水稻根部铁膜促进土壤硝酸盐还原的方法。
背景技术：
氮是农田经淋溶损失的最主要元素之一。土壤中的氮素以有机态和无机态形式存在，有机氮包括易水解和难水解两种形式，无机氮包括游离氮、铵态氮、硝态氮和亚硝态氮。土壤多为带负电荷的胶体，因而易于大量吸附铵态氮，而很难吸附硝态氮。故在降雨和灌水作用下，土壤中的氮素大部分以可溶性的硝态氮淋失。因此在水分管理充分的条件下，控制土壤硝态氮的含量成为控制氮素淋溶损失的主要因素。目前，避免土壤氮素损失的方式主要是在土壤中添加硝化抑制剂，抑制土壤中硝化作用，从而减少硝态氮含量。但硝化抑制剂均为化学物质，容易造成二次污染。利用植物根部铁膜影响土壤中硝酸盐还原的技术尚未见报道，开发一种环境友好型、可操作性强的技术来实现增强硝酸盐还原的方法，对于原位条件下土壤硝酸盐移除的技术具有重要意义。
技术实现要素：
本发明的目的之一在于提供一种促进土壤中硝酸盐还原的方法。
本发明的另一目的在于提供一种富集土壤中还原硝酸盐的微生物的方法。
本发明的又一目的在于提供一种富集土壤中铁氧化还原的微生物的方法。
本发明所采取的技术方案是：
一种促进土壤中硝酸盐还原的方法，其特征在于，诱导水稻根部铁膜形成后将水稻移植于土壤中培养，并将土壤淹水5～9mm，所述淹水时间为9～10d。
进一步的，将水稻种子用10％h2o2溶液浸泡10～15min消毒，用水彻底清洗干净后将种子浸泡在水中，于培养箱中催芽。
进一步的，将催芽的二叶期幼苗移栽到水稻全营养液中培养18-24d，营养液每3d更换一次，ph为5.5-5.8。
进一步的，水稻根部铁膜形成的方法为：将水稻苗于70～80mgl-1硫酸亚铁溶液中诱导培养40～48h。
进一步的，所述的水稻为四叶期幼苗。
进一步的，所述土壤中含有反硝化微生物和/或与反硝化作用耦合的铁氧化还原的微生物。
一种富集土壤中还原硝酸盐的微生物的方法，诱导水稻根部铁膜形成后将水稻种植在土壤中，并将土壤淹水5～9mm；所述淹水时间为9～10d。
进一步的，水稻移植到土壤中后，培养5d后，对土壤进行淹水处理。
进一步的，所述淹水处理的方法为：每盆含土干重1.5kg，加入水并保持淹水层为5～9mm。
进一步的，所述的还原硝酸盐的微生物包括反硝化微生物和铁氧化还原相关的微生物。
进一步的，所述反硝化微生物包括pseudomonas、thoibacillus、thermomonas、bacillus、candidatusnitrososphaera。
进一步的，所述铁氧化还原相关的微生物包括thermomonas、rhodobacter、pseudomonas、dechloromonas、thiobacillus、clostridium、desulfovibrio、alkaliphilus、anaeromyxobacter、desulfotomaculum、alicyclobacillus、bacillus。
一种促进土壤中反硝化作用耦合铁氧化还原的方法，诱导水稻根部铁膜形成后将水稻种植在土壤中，所述土壤中含有能够耦合硝酸盐还原的铁氧化还原微生物。
一种富集土壤中能够耦合硝酸盐还原相关的铁氧化还原微生物的方法，诱导水稻根部铁膜形成后将水稻移植于土壤中，所述能够耦合硝酸盐还原的铁氧化还原微生物包括thermomonas、rhodobacter、pseudomonas、dechloromonas、thiobacillus、clostridium、desulfovibrio、alkaliphilus、anaeromyxobacter、desulfotomaculum、alicyclobacillus、bacillus。
本发明的有益效果是：
(1)水稻铁膜能加强硝酸盐的还原，n2o和n2的排放，并耦合了铁氧化还原的过程。在移植了铁膜水稻(ip)的土壤中，水溶性n2o和反应器顶空n2o的浓度明显高于对照组(ck)的土壤，同时土壤中的硝态氮含量下降，证实了土壤中的硝酸盐可以通过反硝化加强硝酸盐还原过程；
(2)本发明是一种原位条件下以及环境友好型的技术，并且实际可操作性强，能够增强作物根部的微生物硝酸盐还原，并耦合铁氧化还原，从而减少硝酸盐淋失的风险；
(3)本发明能够富集还原硝酸盐的微生物；
(4)本发明适用于铁氧化物含量低并且硝态氮施肥过量的土壤。
通过加强植物根部土壤硝酸盐还原是一种有效减少地下水硝酸盐污染的方式，水稻根部铁膜是一个铁营养库，主要由无定形氧化铁构。迄今为止，仍然缺少植物根部铁膜如何影响土壤中硝酸盐还原的信息。这类信息对于原位条件下土壤硝酸盐移除的技术是必不可少的。
附图说明
图1为水稻的空白对照(ck)和已经诱导形成铁膜(ip)的图片；
图2为在ip组和ck组水稻移栽至土壤中并淹水处理后，其铁膜含量变化(a)、n2o排放速率(b)和可溶性n2o浓度(c)(n＝3)；
图3为在ip组和ck组水稻移栽至土壤中并淹水处理后，其土壤和根部微生物群落的非度量多维尺度(nmds)分析(a)、土体土和根际土微生物群落的非度量多维尺度(nmds)分析(b)和属(c)的相对丰度(n＝3)；图(c)中红色代表铁还原菌，黑色代表铁氧化菌；
图4为土体土和根际土壤微生物群落分析；
图5为水培液体系中置入ip和ck组水稻后，顶空n2o浓度(a)、顶空n2浓度(b)、溶液中加入亚铁离子后ck处理的顶空n2o浓度(c)、溶液中加入edta后ip处理的顶空n2o浓度(d)、ip处理在不同溶液中亚铁离子浓度(e)和溶液中硝态氮浓度(f)(n＝3)。
具体实施方式
一种促进土壤中硝酸盐还原的方法，诱导水稻根部铁膜形成后将水稻移植于土壤中培养，并将土壤淹水5～9mm，所述淹水时间为9～10d。
优选的，将水稻种子用10％h2o2溶液浸泡10～15min消毒，用水彻底清洗干净后将种子浸泡在水中，于培养箱中催芽。
优选的，将催芽的二叶期幼苗移栽到水稻全营养液中培养18-24d，营养液每3d更换一次，ph为5.5-5.8。
优选的，水稻根部铁膜形成的方法为：将水稻苗于70～80mgl-1硫酸亚铁溶液中诱导培养40～48h。
优选的，所述的水稻为四叶期幼苗。
优选的，所述土壤中含有反硝化微生物和/或与反硝化作用耦合的铁氧化还原的微生物。
一种富集土壤中还原硝酸盐的微生物的方法，诱导水稻根部铁膜形成后将水稻种植在土壤中，并将土壤淹水5～9mm；所述淹水时间为9～10d。
优选的，水稻移植到土壤中后，培养5d后，对土壤进行淹水处理。
优选的，所述淹水处理的方法为：每盆含土干重1.5kg，加入水并保持淹水层为5～9mm。
优选的，所述的还原硝酸盐的微生物包括反硝化微生物和铁氧化还原相关的微生物。
优选的，所述反硝化微生物包括pseudomonas、thoibacillus、thermomonas、bacillus、candidatusnitrososphaera。
优选的，所述铁氧化还原相关的微生物包括thermomonas、rhodobacter、pseudomonas、dechloromonas、thiobacillus、clostridium、desulfovibrio、alkaliphilus、anaeromyxobacter、desulfotomaculum、alicyclobacillus、bacillus。
一种促进土壤中反硝化作用耦合铁氧化还原的方法，诱导水稻根部铁膜形成后将水稻种植在土壤中，所述土壤中含有能够还原硝酸盐耦合铁氧化还原的微生物。
一种富集土壤中能够耦合硝酸盐还原相关的铁氧化还原微生物的方法，诱导水稻根部铁膜形成后将水稻移植于土壤中，所述能够耦合硝酸盐相关的铁氧化还原微生物包括thermomonas、rhodobacter、pseudomonas、dechloromonas、thiobacillus、clostridium、desulfovibrio、alkaliphilus、anaeromyxobacter、desulfotomaculum、alicyclobacillus、bacillus。
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1一种铁膜调控土壤中硝酸盐的方法
本次研究采用土壤采集于中国科学院栾城试验站长时间施加氮肥试验的地区(37.90°北纬,114.67°东经,海拔50m)。在试验区采集了5个不同点的表层土壤。先将这些土壤风干并使用孔径为2mm的筛子过筛。土壤粘粒含量为7.3％、粉粒含量为79.8％以及砂粒含量为12.3％。土壤有机质含量为1.9gkg-1、ph为7.1、硝酸盐no3—n为31.3mgkg-1以及可溶解性有机碳浓度4.1mgkg-1。实验时由于使用了肥料，土壤的硝氮浓度达到了43～47mgkg-1。图1为水稻的空白对照(ck)和已经诱导形成铁膜(ip)水稻的图。
(1)将品种名为日本晴的水稻种子用10％h2o2溶液浸泡10min消毒，再用无菌水彻底清洗干净后，将水稻种子浸泡在无菌水中，于30℃培养箱中催芽48h。待种子萌发后，将二叶期幼苗移栽到水稻全营养液中培养21d，营养液每3d更换一次，ph为5.5～5.8。人工气候箱的培养条件为：白昼的时间、温度为14h，28℃；黑夜的时间和温度为10h，25℃，后续实验采用相同的培养条件。
(2)待水稻幼苗生长4周后，选取长势一致的四叶期水稻苗将其分为两组，其转移至水中培养24h，其中对照组的幼苗继续于水中培养48h(ck)，而实验组的幼苗转移至含有80mgl-1的硫酸亚铁溶液中培养48h(ip)。将ck与ip组的水稻分别移栽至圆柱形罐中(φ22×35cm)(ck和ip处理分别准备24个罐，每个罐中载入6株水稻幼苗)，插入土壤使根固定在土壤即可，适应5d之后进行土壤淹水处理，每个罐上覆水的高度为5mm，淹水时间为10d。
(3)用橡胶塞、螺丝和罐盖将罐子密封，气相色谱法测定n2o排放速率；将罐盖打开，用微电极测定可溶性n2o的浓度。然后，对土壤中的nh4+、no3-、no2-以及doc含量进行分析；最后，测定微生物群落结构在土体土、根际土和植物根部的分布。
(4)为了确定硝酸盐分解的主要途径，将ck和ip组的水稻幼苗至于厌氧瓶中，并分别加入nh4+和no3-作为培养液氮源，厌氧瓶连续五次交替进行抽气(0.1kpa)置换为he/o2混合气(79/21％，101.3kpa)过程。所有的厌氧瓶白天放在28℃，晚上放在25℃，光照黑暗交替处理观察240h，选取处理的0、6、11、24、30、48、72、96、103、120、144、192h以及240h的时间点，在ip组和ck处理组中分别随机选取3个厌氧瓶。利用自动采样分析系统对反应器的顶空进行取样，测定n2o以及n2浓度。
(5)为了确定fe(ii)在硝酸盐分解主要途径中的作用，将ck和ip组的水稻根部至于厌氧瓶中，只加入no3-作为培养液氮源，edta和fe(ii)分别加入不同的处理中，厌氧瓶连续五次交替进行抽气(0.1kpa)置换为高纯度的氦气(99.9999％，120kpa)过程(根部以下土壤含氧量极低，几乎为厌氧条件，为了模拟该情况，故使用惰性气体氦气将瓶中的含有氧气的空气置换)。在最后一次充满氦气之后将顶空空气调节为101.3kpa(该压强调为了保持反应器内压强和空气压强一致)。所有的厌氧瓶白天放在28℃，晚上放在25℃，光照黑暗交替处理观察168h，选取处理的0、5、7、12、24、30、36、48、72、120h以及168h的时间点，在ip组和ck处理组中分别随机选取3个厌氧瓶。利用自动采样分析系统对反应器的顶空进行取样，测定n2o浓度。
相应指标的测定方法：
1.土壤中nh4+,no3-,和no2-含量以及doc(土壤溶解性有机碳)的测定方法
顶空气体中的n2o浓度被测定之后，利用1mkcl对土壤中的无机氮进行浸提，并分别用靛酚蓝比色法、双波长分光光度法以及亚硝酸盐分光光度比色法对其中的nh4+、no3-以及no2-进行测定；利用总有机碳分析仪toc仪测定土壤中的doc含量。
2.测定水稻根部铁膜含量、微生物群落结构和可溶性n2o浓度从植物根际到土体土壤水平方向上的浓度变化。
在水稻培养的过程中，采取抛弃取样法，用dcb法(柠檬酸钠-碳酸氢钠-连二亚硫酸钠法)测定水稻根部铁膜的含量。
淹水处理240h后，用n2o微电极对土壤从根际土到土体土水平方向上的可溶解性n2o浓度的空间分布进行测定。将微传感器插入土壤3.5cm深度，通过传感器追踪软件在电脑上对数据进行记录。对溶解性n2o浓度进行测定之后，将土壤分为两个部分(根际土和土体土)。然后，再将植物根部附着的土壤用超声波法洗净，提取植物根部以及根部附着的土壤的dna，并对微生物群落结构进行测定分析。
土壤中微生物总dna是利用mpbio公司的fastdnaspinkit试剂盒进行提取，然后进行测序检测。nanodrop对提取的dna进行质量和数量检查。提取的dna通过16srrna基因测序分析微生物群落结构。
为了进行微生物群落结构分析，使用515f/907r引物对目的基因进行扩增，引物序列如下：
515f:5'-gtgccagcmgccgcggtaa-3'(seqidno：1)；
907r:5'-ccgtcaattcctttragttt-3(seqidno：2)。
相应指标的测定结果：
一、土壤在移植了ck组和ip组水稻后no3-、no2-、nh4+、排放n2o和可溶性n2o的含量变化
相较于ck组，ip组处理显著增加了土壤中的可溶性n2o的浓度和n2o的排放速率(见图2)，但是ip组降低了硝酸盐浓度(见表1)，结果初步证实了铁膜能够显著地加强土壤no3-还原过程。本实验每克干重根所含有的铁量为铁膜含量，随着植物根部的生长，植物的铁氧化物被外界消耗等原因，本实验ip组处理的根部铁膜含量从5.74减少到2.88mgg-1干重根，但仍是ck组处理的铁膜含量的十倍(0.28～0.76mgg-1根干重)，表明铁膜是影响硝酸盐还原的主要因素。
表1种植前与种植140h时罐中no3-、no2-、nh4+、doc平均含量的变化情况(n＝3)
注：不同的字母(a,b)表示对照组与实验组之间存在显著性差异(0.01<p<0.05)。
二、土壤移植了ck组和ip组水稻后，土壤的反硝化微生物、铁氧化还原微生物的相对丰度变化
与ck处理相比，ip处理显著改变了水稻根际土壤和根中铁氧化还原循环中典型细菌的微生物群落结构，增加了相对丰度；通过非度量多维尺度(nmds)分析，发现ip组与ck组之间的根际土壤和根部微生物群落有显著差异(见图3的(a)(b))，一些细菌也参与了土壤反硝化，如pseudomonas、thiobacillus、thermomonas、bacillus、candidatusnitrososphaera(见图4)；参与铁氧化还原，如thermomonas、rhodobacter、pseudomonas、dechloromonas、thiobacillus、clostridium、desulfovibrio、alkaliphilus、anaeromyxobacter、desulfotomaculum、alicyclobacillus、bacillus(见图3(c))。这些结果表明ip处理后硝酸盐还原和n2o排放的增加可能与微生物的铁氧化还原循环有关。
三、水培液中置入ck组和ip组水稻后，n2o、n2、fe(ii)和no3-的浓度变化
为了确定硝酸盐分解的主要途径和fe(ii)在硝酸盐分解主要途径中的作用，进行了水培液的实验。结果表明ip组的处理明显增加了以no3-为唯一氮源的n2o排放，并同时增加了n2的排放，降低了no3-浓度，但在nh4+溶液中这种差异不明显(见图5a、图5b和图5f)。结果证明了硝酸盐还原是以反硝化途径为主，进一步证实铁膜能够显著地加强no3-还原。
在无铁膜的情况下，fe(ii)的加入使得n2o排放量显著增加；而在no3-溶液中通过edta螯合铁膜上的铁离子则显著降低了n2o的排放。这些结果表明，fe(ii)氧化可能与反硝化作用相耦合，并促进了土壤硝酸盐还原以及n2o排放的增加(见图5c、图5d)。在无硝酸根存在的情况下，fe(ii)会逐渐从铁膜上分解下来，所以fe(ii)含量是增加的趋势，而在硝酸根同时存在的情况下，由于亚铁氧化和硝酸盐还原耦合作用，所以铁膜上分解下来的fe(ii)被逐渐消耗，因此fe(ii)含量是逐渐下降或者持平的趋势(见图5e)。
综上所述，相较于ck组，ip组在水培液中能明显促进n2的排放，且浓度远高于n2o的排放(相同实验条件下n2的浓度单位为μmoll-1，n2o的浓度单位为nmoll-1，相差了103倍)，因此结果表明fe(ii)氧化可能与反硝化作用相耦合，并促进了土壤硝酸盐还原以及n2排放的增加。本发明在土壤环境种入诱导了铁膜的水稻，铁膜处理可以增强土壤环境中的硝酸盐还原，使得水稻根际土壤能够发生fe(ii)氧化耦合的反硝化反应。反硝化微生物和铁氧化还原相关的微生物得到显著富集；有铁膜处理的土壤以及对照处理土壤实时动态监测土壤n2o排放速率以及硝酸盐、亚硝酸盐、铵根浓度和doc浓度，以及微生物群落结构的分布差异、可溶解性n2o浓度的检测数据均可证实这一结论。
实施例2一种促进土壤中硝酸盐还原的方法
将水稻苗转移在70mgl-1硫酸亚铁溶液诱导48h，将处理后的水稻苗移植于土壤中，种植4d，并将土壤淹水4mm，淹水时间为9d。
实施例3一种促进土壤中硝酸盐还原的方法
将水稻苗转移在70mgl-1硫酸亚铁溶液诱导48h，将处理后的水稻苗移植于土壤中，种植5d，并将土壤淹水5mm，淹水时间为10d。
上述结果表明通过土壤中种入诱导铁膜的水稻，在人为调控的环境中，与硝酸盐还原、铁氧化还原相关的微生物被富集，终产物主要为n2。这些结果表明铁膜调控处理是一种对于植物根际区域硝酸盐还原以及防止地下水硝酸盐污染方面具有针对性的环境友好型的技术。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。