本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种基于石仙桃种子的原球茎培养的方法。
技术背景
石仙桃(pholidotachinensislindl.)系兰科(orchidaceae)石仙桃属(pholidota)多年附生草本植物，俗称石橄榄。植株高15-25㎝，由须根、根状茎、假鳞茎、叶、花、果组成(林来官,张永田等.福建植物志[m].福州:福建科学技术出版社,1994,第六卷:636-637)。在我国，石仙桃分布于福建、广东、广西和云南等省，在福建省，石仙桃主要分布于福州、平和、长乐、南靖等地区。石仙桃生于林中或林缘树上、岩壁上或岩石上，海拔通常在1500m以下，少数可达2500m(陈心启,吉占和,郎楷永等.中国植物志[m].北京:科学出版社,1999,18:388-399)。
石仙桃作为中草药具有悠久的历史，始载于《生草药性备要》。以全草或假鳞茎入药，其性甘味凉，具有养阴、清热、利湿消瘀的功效(南京中医药大学.中药大辞典[m].上海:上海科学出版社,2006)，民间常用来治疗高血压、头晕和各种原因引起的头疼等。用其制成的“头痛定糖浆”临床上用于治疗神经功能性头痛、脑震荡后遗症，已应用多年，治疗效果良好(中华人民共和国药典委员会.中药成方制剂(第九册).北京:北京化学工业出版社,1994:67)。
近几年对其药理进行了比较多的研究，报道其在镇静、催眠、抗癌、抗疲劳等方面都有作用(刘建新,周青,连其深.石仙桃对中枢神经系统抑制作用.赣南医学院学报,2004,24(2):119-121；王光辉,郭晓宇,王乃利等.云南石仙桃氯仿萃取物活性部位对入肝癌细胞hepg2的周期抑制作用.沈阳药科大学学报,2006,23(4):240-243；刘建新,周青,连其深.石仙桃的镇痛作用的研究.赣南医学院学报,2002,22(2):105-107)。同时现在对其化学成分做了不同方法的提取和分离，得到天麻苷元、原儿茶醛、胡萝卜苷等化学成分(舒文海.石仙桃的局麻作用研究.中国药学杂志,1989,24(5):304；林丽聪,张怡评,吴春敏等.石仙桃叶化学成分研究.时珍国医国药,2009,20(4):922-923；李兵,郭环娟,容羡贤.石仙桃质量标准研究.中国药业,2010,19(6):19-20；林丽聪,吴春敏,陈海滨等.rp—hplc法测定石仙桃中天麻素和天麻苷元.中草药.2008,39(2):283-285)。
随着临床对石仙桃研究的深入和新功能的开发，人们的需求量与日俱增，但由于其生长缓慢、生物量小、自然繁殖率低、对生境要求苛刻，自然资源贮藏量及可开发利用量非常有限，长期掠夺式采挖野生资源，已导致野生资源锐减并逐渐匮乏，不少原产地石仙桃资源呈现稀缺甚至濒危趋势。
技术实现要素：
本发明提供一种基于石仙桃种子的原球茎培养的方法，采用本方法能将石仙桃种子培育为石仙桃原球茎，而且该原球茎增殖效率高。
本发明通过以下技术方案实现：
一种基于石仙桃种子的原球茎培养的方法，所述的方法包括以下依序进行的步骤：
(1)外植体的准备阶段
于每年11月至次年的3月采集野生的且无开裂的石仙桃蒴果；
(2)无菌处理阶段
将步骤(1)所准备的石仙桃蒴果，用无菌水冲洗干净；
然后转移到灭菌后的超净工作台上，用71-74％的酒精棉擦拭蒴果表面，再用无菌水冲洗干净，之后转入到无菌瓶内，用0.1-1.6％的升汞灭菌8-18分钟，最后用无菌水冲洗干净；
(3)初代萌动阶段
接着切开步骤(2)中灭菌好的蒴果，将种子撒播在初代萌动培养基上，培养20-30天，培养环境如下：ph为5.6-5.9，温度为24±2℃，黑暗条件下，置于摇床上，转速30-50转/分钟；本初代萌动培养基为半固体培养基，放置于摇床上，防止种子长期浸泡在水中，因缺氧而不会发芽，同时缓慢摇动，改变着种子萌动后细胞向地性，更有利于原球茎的形成；
(4)原球茎培养及增殖阶段
将经步骤(3)初代萌动阶段的种子，接种到原球茎培养及增殖培养基中培养45-55天，培养环境如下：ph为5.8-6.0，温度为24±2℃，置于摇床上，转速50-70转/分钟，光照强度500-1500lx，光照周期为10-14h/d。本原球茎培养及增殖培养基为液体培养基，放置于摇床上，防止萌动的胚长期浸泡在水中，因缺氧而直接死亡，同时缓慢摇动，改变着胚萌动后细胞向地性，更有利于原球茎的形成。
进一步地，所述的初代萌动培养基主要由以下物质组成：硝酸铵1400-1500mg/l+硝酸钾1710-1810mg/l+氯化钙550-700mg/l+硫酸镁400-450mg/l+磷酸二氢钾200-250mg/l+硼酸6.0-6.5mg/l+乙二胺四乙酸二钠37.0-37.5mg/l+硫酸锰22.0-23.0mg/l+硫酸锌9.0-10.0mg/l+硫酸铁27.0-28.0mg/l+肌醇90-100mg/l+椰子汁30-60g/l+花宝2号0.1-0.3g/l+蛋白胨0.7-0.9g/l+蔗糖12-17g/l+琼脂3-5g/l。
进一步地，所述的原球茎培养及增殖培养基主要由以下物质组成：硝酸铵1400-1500mg/l+硝酸钾1710-1810mg/l+氯化钙550-700mg/l+硫酸镁400-450mg/l+磷酸二氢钾200-250mg/l+硼酸6.0-6.5mg/l+乙二胺四乙酸二钠37.0-37.5mg/l+硫酸锰22.0-23.0mg/l+硫酸锌9.0-10.0mg/l+硫酸铁27.0-28.0mg/l+肌醇90-100mg/l+6-ba1.2-1.8mg/l+naa0.1-0.4mg/l+2,4-d0.2-0.5mg/l+花宝2号0.6-0.9g/l+椰子汁80-100g/l+酵母提取物6-9g/l+水解酪蛋白4-8g/l+蔗糖12-17g/l。
进一步地，所述的初代萌动培养基中的椰子汁的浓度为45g/l，花宝2号的浓度为为0.2g/l，蛋白胨的浓度为0.8g/l，蔗糖的浓度为14g/l，琼脂的浓度为0.4％。
进一步地，所述的原球茎培养及增殖培养基中6-ba的浓度为1.6mg/l，naa的浓度为0.3mg/l，2,4-d的浓度为0.4mg/l，花宝2号的浓度为0.7g/l，椰子汁的的浓度为90g/l，酵母提取物的浓度为7g/l，水解酪蛋白的浓度为6g/l，蔗糖的浓度为14g/l。
较之前的现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明能培育出石仙桃的原球茎，而且该原球茎增殖效率高，平均一颗种子约分化生成6.33个原球茎。
采用原球茎培养体系能进行发酵罐培养生产次生代谢产物，从而能解决因田间生长缓慢而不能满足单一化学物质提取的需求。
为通过原球茎快速繁殖种苗奠定了基础。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进一步阐述：但是不只仅仅局限于以下实施例，凡是依据本发明原理的任何改进或替换，均应在本发明的保护范围之内。
实施例1
一种基于石仙桃种子的原球茎培养的方法，所述的方法包括以下依序进行的步骤：
(1)外植体的准备阶段
于每年11月至次年的3月采集野生的且无开裂的石仙桃蒴果；
(2)无菌处理阶段
将步骤(1)所准备的石仙桃蒴果，用无菌水冲洗干净；
然后转移到灭菌后的超净工作台上，用71-74％(优选73％)的酒精棉擦拭蒴果表面，再用无菌水冲洗干净(优选冲洗3-5次)，之后转入到无菌瓶内，用0.1-1.6％(优选1.5％)的升汞灭菌8-18分钟(预选12分钟)，最后用无菌水冲洗干净(优选冲洗3-5次)；
(3)初代萌动阶段
接着切开步骤(2)中灭菌好的蒴果，将种子撒播在初代萌动培养基上，培养20-30天，培养环境如下：ph为5.6，温度为24±2℃，黑暗条件下，置于摇床上，转速30转/分钟；
(4)原球茎培养及增殖阶段
将经步骤(3)初代萌动阶段的种子，接种到原球茎培养及增殖培养基中培养45-55天，培养环境如下：ph为5.8，温度为24±2℃，置于摇床上，转速50-70转/分钟，光照强度500lx，光照周期为14h/d。
初代萌动阶段的种子慢慢开始吸水膨大，胚逐步突破种皮。
原球茎培养及增殖阶段胚突破种皮后，慢慢变大，逐步形成原球茎，并慢慢生长为原球茎丛，随着转动，有些新生原球茎会逐步脱落，然后进一步生长为原球茎丛，然后接着按照上面所述的过程生长。
本实施例所述的初代萌动培养基和原球茎培养及增殖培养基均可以为基本培养基。
根据植物种子的萌发特性，选择了黑暗、1500lx、2500lx，结果表明，黑暗条件下，更有利于种子萌动，并且萌动速率较2500lx快8天左右。
根据植物种子的萌发特性，选择了黑暗、500lx、1500lx、2500lx，结果表明500lx-1500lx更有利于原球茎形成，黑暗条件下，原球茎易于黄化，而2500lx条件下，生长速度较慢。
实施例2
一种基于石仙桃种子的原球茎培养的方法，所述的方法包括以下依序进行的步骤：
(1)外植体的准备阶段
于每年11月至次年的3月采集野生的且无开裂的石仙桃蒴果；
(2)无菌处理阶段
将步骤(1)所准备的石仙桃蒴果，用无菌水冲洗干净；
然后转移到灭菌后的超净工作台上，用71-74％(优选73％)的酒精棉擦拭蒴果表面，再用无菌水冲洗干净(优选冲洗3-5次)，之后转入到无菌瓶内，用0.1-1.6％(优选1.5％)的升汞灭菌8-18分钟(预选12分钟)，最后用无菌水冲洗干净(优选冲洗3-5次)；
(3)初代萌动阶段
接着切开步骤(2)中灭菌好的蒴果，将种子撒播在初代萌动培养基上，培养20-30天，培养环境如下：ph为5.9，温度为24±2℃，黑暗条件下，置于摇床上，转速50转/分钟；
(4)原球茎培养及增殖阶段
将经步骤(3)初代萌动阶段的种子，接种到原球茎培养及增殖培养基中培养45-55天，培养环境如下：ph为6.0，温度为24±2℃，置于摇床上，转速70转/分钟，光照强度1500lx，光照周期为10h/d。
实施例3
一种基于石仙桃种子的原球茎培养的方法，所述的方法包括以下依序进行的步骤：
(1)外植体的准备阶段
于每年11月至次年的3月采集野生的且无开裂的石仙桃蒴果；
(2)无菌处理阶段
将步骤(1)所准备的石仙桃蒴果，用无菌水冲洗干净；
然后转移到灭菌后的超净工作台上，用71-74％(优选73％)的酒精棉擦拭蒴果表面，再用无菌水冲洗干净(优选冲洗3-5次)，之后转入到无菌瓶内，用0.1-1.6％(优选1.5％)的升汞灭菌8-18分钟(预选12分钟)，最后用无菌水冲洗干净(优选冲洗3-5次)；
(3)初代萌动阶段
接着切开步骤(2)中灭菌好的蒴果，将种子撒播在初代萌动培养基上，培养20-30天，培养环境如下：ph为5.8，温度为24±2℃，黑暗条件下，置于摇床上，转速40转/分钟；
(4)原球茎培养及增殖阶段
将经步骤(3)初代萌动阶段的种子，接种到原球茎培养及增殖培养基中培养45-55天，培养环境如下：ph为5.9，温度为24±2℃，置于摇床上，转速60转/分钟，光照强度1000lx，光照周期为12h/d。
实施例4
与上述实施例不同的是，本实施例所述的初代萌动培养基为：硝酸铵1400-1500mg/l+硝酸钾1710-1810mg/l+氯化钙550-700mg/l+硫酸镁400-450mg/l+磷酸二氢钾200-250mg/l+硼酸6.0-6.5mg/l+乙二胺四乙酸二钠37.0-37.5mg/l+硫酸锰22.0-23.0mg/l+硫酸锌9.0-10.0mg/l+硫酸铁27.0-28.0mg/l+肌醇90-100mg/l+椰子汁45g/l+花宝2号0.2g/l+蛋白胨0.8g/l+蔗糖14g/l+琼脂4g/l。
实施例5
与上述实施例不同的是，本实施例所述的初代萌动培养基为：硝酸铵1400-1500mg/l+硝酸钾1710-1810mg/l+氯化钙550-700mg/l+硫酸镁400-450mg/l+磷酸二氢钾200-250mg/l+硼酸6.0-6.5mg/l+乙二胺四乙酸二钠37.0-37.5mg/l+硫酸锰22.0-23.0mg/l+硫酸锌9.0-10.0mg/l+硫酸铁27.0-28.0mg/l+肌醇90-100mg/l+椰子汁30g/l+花宝2号0.1g/l+蛋白胨0.7g/l+蔗糖12g/l+琼脂3g/l。
实施例6
与上述实施例不同的是，本实施例所述的初代萌动培养基为：硝酸铵1400-1500mg/l+硝酸钾1710-1810mg/l+氯化钙550-700mg/l+硫酸镁400-450mg/l+磷酸二氢钾200-250mg/l+硼酸6.0-6.5mg/l+乙二胺四乙酸二钠37.0-37.5mg/l+硫酸锰22.0-23.0mg/l+硫酸锌9.0-10.0mg/l+硫酸铁27.0-28.0mg/l+肌醇90-100mg/l+椰子汁60g/l+花宝2号0.3g/l+蛋白胨0.9g/l+蔗糖17g/l+琼脂5g/l。
实施例7
与上述实施例不同的是，本实施例所述的原球茎培养及增殖培养基为硝酸铵1400-1500mg/l+硝酸钾1710-1810mg/l+氯化钙550-700mg/l+硫酸镁400-450mg/l+磷酸二氢钾200-250mg/l+硼酸6.0-6.5mg/l+乙二胺四乙酸二钠37.0-37.5mg/l+硫酸锰22.0-23.0mg/l+硫酸锌9.0-10.0mg/l+硫酸铁27.0-28.0mg/l+肌醇90-100mg/l+6-ba1.6mg/l+naa0.3mg/l+2,4-d0.4mg/l+花宝2号0.7g/l+椰子汁90g/l+酵母提取物7g/l+水解酪蛋白6g/l+蔗糖1.4％。本实施例的增殖率高达6.33，原球茎生长快。
实施例8
与上述实施例不同的是，本实施例所述的原球茎培养及增殖培养基为硝酸铵1400-1500mg/l+硝酸钾1710-1810mg/l+氯化钙550-700mg/l+硫酸镁400-450mg/l+磷酸二氢钾200-250mg/l+硼酸6.0-6.5mg/l+乙二胺四乙酸二钠37.0-37.5mg/l+硫酸锰22.0-23.0mg/l+硫酸锌9.0-10.0mg/l+硫酸铁27.0-28.0mg/l+肌醇90-100mg/l+6-ba1.2mg/l+naa0.1mg/l+2,4-d0.2mg/l+花宝2号0.6g/l+椰子汁80g/l+酵母提取物6g/l+水解酪蛋白4g/l+蔗糖12g/l。
实施例9
与上述实施例不同的是，本实施例所述的原球茎培养及增殖培养基为硝酸铵1400-1500mg/l+硝酸钾1710-1810mg/l+氯化钙550-700mg/l+硫酸镁400-450mg/l+磷酸二氢钾200-250mg/l+硼酸6.0-6.5mg/l+乙二胺四乙酸二钠37.0-37.5mg/l+硫酸锰22.0-23.0mg/l+硫酸锌9.0-10.0mg/l+硫酸铁27.0-28.0mg/l+肌醇90-100mg/l+1.8mg/l6-ba+0.4mg/lnaa+0.5mg/l2,4-d+0.9g/l花宝2号+100g/l椰子汁+9g/l酵母提取物+8g/l水解酪蛋白+17g/l蔗糖。
所述初代萌动培养基及原球茎培养及增殖培养基中，硝酸铵1400-1500mg/l+硝酸钾1710-1810mg/l+氯化钙550-700mg/l+硫酸镁400-450mg/l+磷酸二氢钾200-250mg/l+硼酸6.0-6.5mg/l+乙二胺四乙酸二钠37.0-37.5mg/l+硫酸锰22.0-23.0mg/l+硫酸锌9.0-10.0mg/l+硫酸铁27.0-28.0mg/l+肌醇90-100mg/l为基本培养基。
下面结合表1对培养基和添加物对种子发芽率的影响进行说明，表1中的添加物一为30g/l椰子汁+0.1g/l花宝2号+0.7g/l蛋白胨+12g/l蔗糖+3g/l琼脂；添加物二为45g/l椰子汁+0.2g/l花宝2号+0.8g/l蛋白胨+14g/l蔗糖+4g/l琼脂；添加物三为60g/l椰子汁+0.3g/l花宝2号+0.9g/l蛋白胨+17g/l蔗糖+5g/l琼脂。以基本培养基+45g/l椰子汁+0.2g/l花宝2号+0.8g/l蛋白胨+14g/l蔗糖+4g/l琼脂为佳，萌动率高，可达88％，生长整齐。
表1不同培养基对种子发芽率的影响
根据石仙桃植物体内矿质元素含量分析及培养基上的生长表现，选定了基本培养基的成分种类和含量，在上述基本培养基、ms、b5培养基中分别加入相同的30-60g/l椰子汁+0.1-0.3g/l花宝2号+0.7-0.9g/l蛋白胨+1.2-1.7％蔗糖+0.3-0.5％琼脂，结果表明，以上述基本培养基+30-60g/l椰子汁+0.1-0.3g/l花宝2号+0.7-0.9g/l蛋白胨+1.2-1.7％蔗糖+0.3-0.5％琼脂萌动率最高，可达85.33％以上，其次为ms萌动率为80.67％，而b5组合的萌动率仅为63％，表明此基本培养基适宜于石仙桃种子萌动。与常用的ms、b5等种类的培养基相比，此基本培养基配方简单，并且由常见的成分定量改为一定的称量区间，在上限与下限范围内的量，对萌动率没有影响，但增加了配方的操作性，使其易于称量和操作。
将萌动后的种子，继代到增殖培养基中，培养环境ph为5.8-6.0，温度24±2℃，置于摇床上，转速45-70转/分钟，光照强度500-1500lx，光照周期为12h/d，培养周期45-55天。根据植物种子的萌发特性，选择了黑暗、500lx、1500lx、2500lx，结果表明500lx-1500lx更有利于原球茎形成，黑暗条件下，原球茎易于黄化，而2500lx条件下，生长速度较慢。
所述继代增殖培养基为：基本培养基+1.2-1.8mg/l6-ba+0.1-0.4mg/lnaa+0.2-0.5mg/l2,4-d+0.6-0.9g/l花宝2号+80-100g/l椰子汁+6-9g/l酵母提取物+4-8g/l水解酪蛋白+1.2-1.7％蔗糖，其中6-ba是6-苄氨基腺嘌呤；naa是a-萘乙酸；2,4-d为2，4-二氯苯氧乙酸。其中以基本培养基+1.6mg/l6-ba+0.3mg/lnaa+0.4mg/l2,4-d+0.7g/l花宝2号+90g/l椰子汁+7g/l酵母提取物+6g/l水解酪蛋白+1.4％蔗糖为佳，繁殖系数高达6.33，原球茎生长快。
表2不同培养基对原球茎增值率的影响
表2中的添加物为1.6mg/l6-ba+0.3mg/lnaa+0.4mg/l2,4-d+0.7g/l花宝2号+90g/l椰子汁+7g/l酵母提取物+6g/l水解酪蛋白+1.4％蔗糖。
从表2可知，在上述基本培养基、ms、b5培养基中分别加入相同的1.2-1.8mg/l6-ba+0.1-0.4mg/lnaa+0.2-0.5mg/l2,4-d+0.6-0.9g/l花宝2号+80-100g/l椰子汁+6-9g/l酵母提取物+4-8g/l水解酪蛋白+1.2-1.7％蔗糖，结果表明，以上述基本培养基+1.2-1.8mg/l6-ba+0.1-0.4mg/lnaa+0.2-0.5mg/l2,4-d+0.6-0.9g/l花宝2号+80-100g/l椰子汁+6-9g/l酵母提取物+4-8g/l水解酪蛋白+1.2-1.7％蔗糖，琼脂增殖系数最高，可达6.33，其次为ms增殖系数为3.33，而b5组合的增殖系数仅为2.0。