一种提高灵芝子实体中灵芝三萜含量的方法与流程

本发明属于食用菌栽培技术领域，具体涉及一种提高灵芝子实体中灵芝三萜含量的方法。

背景技术：

灵芝(ganodermalucidum)是我国传统的药用真菌，其药用价值在我国已经有2000多年的历史记载。灵芝三萜是其主要化学和药效成分之一，具有抗癌、降血压、抗肿瘤等生理活性。现提高灵芝三萜含量的工艺多集中在如何提高灵芝菌丝体内的灵芝三萜含量，主要方法包括：(1)通过培养条件的优化，如培养基成分、温度、ph、氧气及发酵过程中振荡/静止的培养时间。(2)通过物理刺激，如热激。(3)通过化学诱导，如乙烯、茉莉酸甲酯、微晶纤维素等，均可诱导菌丝体内灵芝三萜的生物合成。但是灵芝三萜属于次生代谢产物，会随着灵芝子实体的生理成熟而不断增加，因此，灵芝子实体内灵芝三萜含量会显著高于菌丝体内的灵芝三萜含量，并且近年来我国灵芝的栽培规模越来越大，2015年我国栽培的灵芝约占全球的75％，已成为世界灵芝的主要出口国，灵芝产品年产值超过25亿美元。

若能在灵芝生产过程中提高灵芝子实体中的灵芝三萜含量将大大提高灵芝的药用价值及商品价值。上述提高菌丝体阶段的灵芝三萜方法暂不适用于提高灵芝子实体中的灵芝三萜含量，主要原因是由于灵芝在营养生长阶段靠丝状的菌丝体来吸收营养成分，因此在菌丝体阶段较易受到外界环境条件和诱导物的刺激，但是当灵芝的菌丝体扭结形成原基后，由营养生长转入生殖生长，菌丝体相应的扭结形成原基，随着原基的不断分化，发育成木栓质的成熟子实体，此时，子实体木质化程度较大，不易受外界环境的影响。因此，研究如何提高灵芝子实体中三萜含量，对灵芝的生产加工利用具有重要的意义。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明提供一种提高灵芝子实体中灵芝三萜含量的方法。本发明主要是在灵芝原基形成期施用醋酸钠-水杨酸复合诱导剂，可使灵芝子实体中的三萜含量大幅提升。

本发明采用以下技术方案：

本发明第一个方面，提供一种复合诱导剂，所述复合诱导剂包括醋酸钠和水杨酸。

进一步地，所述复合诱导剂由相同体积相同浓度的醋酸钠溶液和水杨酸溶液混合而成。

进一步地，醋酸钠溶液、水杨酸溶液浓度分别为1～4mm。

本发明第二个方面，提供以上所述复合诱导剂在提高灵芝子实体中灵芝三萜含量中的应用。

进一步地，应用以上所述复合诱导剂时现用现配制。

本发明第三个方面，提供一种提高灵芝子实体中灵芝三萜含量的方法，包括在灵芝原基期时，对灵芝原基喷施8～10次以上所述复合诱导剂，每隔3天喷施一次。本发明采用在原基期进行处理，主要因为灵芝进入幼芝期之后，子实体表明已经开始形成漆样光泽的皮壳层，而且皮壳层较厚，诱导效果受到限制。

进一步地，所述方法具体包括以下步骤：

(1)灵芝培养基的配制和灵芝菌丝体的接种；

(2)菌丝体的培养；

(3)待菌丝长满菌袋后，进行出菇管理，提高空气相对湿度至80％～90％，温度25～28℃，光照强度2500～3500lux，每天通风2～3次，刺激灵芝菌丝扭结形成原基；

(4)在灵芝进入原基期时，喷施8～10次以上所述复合诱导剂，每隔3天喷施一次；

(5)待灵芝子实体的白色边缘消失，进行采摘。

进一步地，灵芝培养基固体原料及其重量百分比为：木屑78％，麦麸20％，石灰1％，石膏1％；培养基含水量65％～70％，121℃灭菌2h。

进一步地，菌丝体培养温度为28℃，避光培养。

进一步地，每次喷施以上所述复合诱导剂5～20ml/株，优选的，所述复合诱导剂20ml/株；对灵芝原基喷施处理后不要立刻喷水加湿，待处理2h再正常加湿。

本发明通过对醋酸钠溶液和水杨酸溶液浓度的梯度试验，确定1～4mm的醋酸钠溶液和水杨酸溶液混合对提高灵芝三萜的含量较佳，低于此浓度范围，灵芝三萜含量增加不显著；而高于此浓度，会造成灵芝局部生长过快，在灵芝子实体的下方会造成瘤状的突起，影响灵芝的商品价值。

本试验除采用水作为空白对照外，还采用醋酸进行处理，据文献报道，醋酸可以显著提高菌丝体阶段的灵芝三萜含量，但是本试验结果表明，虽然醋酸可以诱导灵芝三萜含量略有升高，但是。因此，由于灵芝菌丝体和子实体存在显著差异，如何筛选一种对子实体阶段行之有效的提高灵芝三萜含量的方法势在必行。

本发明取得的有益效果：

本发明首先发现醋酸钠-水杨酸配合可提高灵芝子实体中灵芝三萜的含量。本发明方法可使灵芝子实体中三萜含量提高35％，生物学效率提高8.4％。并且本发明方法培育得到的灵芝发育优良，无瘤状凸起，外形美观。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1.不同诱导剂对灵芝三萜含量的影响；

图2.浓度分别为6mm醋酸钠和水杨酸的混合溶液对灵芝子实体形态变化的影响；

图3.灵芝子实体生长发育过程中的不同阶段；

图4.不同处理组子实体的生长状况。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例1一种复合诱导剂

所述复合诱导剂由4mm醋酸钠溶液和4mm水杨酸溶液等体积混合得到。水杨酸不易溶于水，并且易分解，所以水杨酸在配制过程中要用少量乙醇进行溶解后，再用水稀释成终浓度，每次使用前，现用现配。

实施例2一种提高灵芝子实体中灵芝三萜含量的方法

所述方法包括以下步骤：

(1)灵芝培养基的配制和灵芝菌丝体的接种；灵芝培养基固体原料及其重量百分比为：木屑78％，麦麸20％，石灰1％，石膏1％；培养基含水量70％，121℃灭菌2h，待冷却后接种灵芝菌丝体。

(2)菌丝体的培养：菌丝体培养温度为28℃，避光培养。

(3)待菌丝长满菌袋后，进行出菇管理，提高空气相对湿度至85％，温度28℃，光照强度3000lux，每天通风2～3次，刺激灵芝菌丝扭结形成原基；

(4)在灵芝进入原基期时，喷施8～10次实施例1所述复合诱导剂，每隔3天喷施一次，每次喷施以上所述复合诱导剂20ml/株；对灵芝原基喷施处理后不要立刻喷水加湿，待处理2h再正常加湿。

(5)待灵芝子实体的白色边缘消失，进行采摘。

试验例

灵芝三萜含量的测定方法：

取灵芝干粉0.2g，加入无水乙醇定容至10ml，超声破碎2h，摇匀，4000g离心10min，保留上清液。吸取0.1ml上清液，加入0.2ml5％香草醛-冰醋酸溶液及0.5ml高氯酸溶液，摇匀，60℃加热20min，取出后立即放入冰浴中冷却10min，加入冰醋酸5ml，在550nm处测定反应液的吸光度，乙醇作为空白对照。

灵芝三萜含量的计算公式：w(mg/g)＝cv1/mv2×100％

c(μg)：以标准曲线上查得样品分解液的三萜含量；

v1(ml)：样品定容体积；

v2(ml)：样品分解液体积；

m(g)：样品质量。

计算生物学效率的公式：子实体的鲜重/培养料的干重×100％

(1)不同诱导剂对提高灵芝子实体三萜含量的影响

本试验分别探究了醋酸、醋酸钠、水杨酸三种诱导剂对灵芝子实体中三萜含量的影响。具体诱导方法同实施例2方法相似，三种诱导剂浓度分别为4mm，以喷施水作为对照。

试验结果如图1所示，喷施醋酸钠组子实体中三萜含量增加极为显著，喷施水杨酸组子实体中三萜含量增加显著，醋酸处理组灵芝三萜含量与空白对照组无显著性差异。

在以上试验基础上，本发明进一步探究了醋酸钠、水杨酸及其配合对灵芝子实体中三萜含量及灵芝子实体生物学效率的影响。

设置四组试验：组1：空白对照组(ck)；组2：单独喷施醋酸钠溶液，醋酸钠溶液浓度为4mm；组3：喷施醋酸钠和水杨酸混合溶液，醋酸钠、水杨酸溶液浓度分别为4mm；组4：单独喷施水杨酸溶液，水杨酸溶液浓度为4mm；每组设三个平行。试验结果如表1、表2所示。

表1不同处理对灵芝三萜含量的影响

由表1可知，喷施醋酸钠和水杨酸混合溶液组灵芝子实体中三萜含量提高最为显著。

表2不同处理对灵芝子实体生物学效率的影响

由表2可知，喷施醋酸钠和水杨酸混合溶液组灵芝子实体生物学效率最高。此外，本发明设置了对醋酸钠溶液和水杨酸溶液浓度的梯度试验，发现浓度分别为4mm的醋酸钠溶液、水杨酸溶液按等体积混合后，作用效果最佳，高于此浓度，会造成灵芝局部生长过快，在灵芝子实体的下方会造成瘤状的突起，影响灵芝的商品价值，如图2所示。

根据以上试验结果，分析其作用原理，可能为：灵芝三萜的生物合成主要是通过甲羟戊酸途径进行生物合成，甲羟戊酸途径以乙酰辅酶a开始经过一系列的酶促反应形成不同结构的灵芝三萜。醋酸钠中的醋酸根离子可以使乙酰辅酶a合成酶上调表达，提高了乙酰辅酶a的含量，通过提供更多的甲羟戊酸途径的起始物，从而提高灵芝三萜的含量。而醋酸钠中的钠离子可以通过na⁺/ca²⁺离子交换，提高细胞内的ca²⁺浓度，从而通过钙信号通路提高灵芝三萜的含量。水杨酸促进灵芝三萜生物合成的原理是可以诱导甲羟戊酸途径中关键酶的上调表达，如羟甲基戊二酰辅酶a还原酶(hmgr)、鲨烯合酶(sqs)和羊毛甾醇合酶(osc)的上调表达，从而提高灵芝三萜的含量。

综上所述，施用醋酸钠和水杨酸混合不仅可以提高灵芝中的灵芝三萜含量，而且还可以提高灵芝子实体的生物学效率，从而在提高灵芝三萜含量的同时还可以达到增产的目的。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。